HMGB1的重組及其在血管生成中的作用.pdf

1、血管生成與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。炎癥是導(dǎo)致血管異常增生的關(guān)鍵因素,而Toll樣受體(Toll-likereceptors,TLRs)在炎癥應(yīng)答中起重要作用。因此,本研究擬通過(guò)角膜血管生成(cornealneovascularization,CNV)模型,探討TLR4及其內(nèi)源性配體——高遷移率族蛋白B1(high-mobilitygroupbox-1,HMGB1)在炎癥導(dǎo)致的血管生成中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)分子克隆方法構(gòu)

2、建HMGB1全長(zhǎng)、HMGB1Abox和Bbox的表達(dá)載體,提純出具有生物活性的重組蛋白,并免疫新西蘭兔制備抗HMGB1多克隆抗體,體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)鑒定抗體的純度、特異性、活性和效價(jià)。之后建立小鼠堿燒傷CNV模型,通過(guò)基因敲除和拮抗劑阻斷等手段,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)、組織病理學(xué)等檢測(cè)方法,從分子、細(xì)胞和整體水平上探討內(nèi)源性HMGB1-TLR4信號(hào)通路在調(diào)節(jié)生物活性介質(zhì)的表達(dá)、巨噬

3、細(xì)胞的局部活化浸潤(rùn)等方面的作用。
　　研究結(jié)果顯示,TLR4基因的缺失可明顯抑制堿燒傷CNV的形成,減少燒傷角膜局部巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)等生長(zhǎng)因子的生成;而TLR2基因的缺失對(duì)CNV形成無(wú)明顯影響。研究還發(fā)現(xiàn)野生型(wildtype,WT)CNV模型小鼠角膜局部HMGB1和TLR4表達(dá)上調(diào)。燒傷角膜局部外用HMGB1活性蛋白可加重WT小鼠CNV的

4、形成及角膜局部巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),但卻對(duì)TLR4-/-小鼠無(wú)明顯效果;HMGB1刺激體外收集的WT小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后,其VEGF等生長(zhǎng)因子表達(dá)上調(diào)的幅度顯著高于TLR4-/-腹腔巨噬細(xì)胞,印證了體內(nèi)CNV模型HMGB1給藥的觀(guān)察結(jié)果。HMGB1和TLR4的特異性拮抗劑眼表給藥抑制WT小鼠CNV的形成及角膜局部巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),從另一角度說(shuō)明了內(nèi)源性HMGB1-TLR4信號(hào)通路在CNV形成中的重要作用。
　　總之,研究結(jié)果表明堿燒傷角膜局部?jī)?nèi)