PTEN磷酸化修飾在HMGB1誘導的小鼠系膜細胞增殖中的作用及其調(diào)控機制.pdf

1、目的：探討PTEN的磷酸化修飾是否參與HMGB1誘導的小鼠系膜細胞增殖及其磷酸化修飾的調(diào)控機制。
　　方法：
　　1以小鼠系膜細胞（mouse mesangial cell, MMC）為研究對象，100μg.L-1HMGB1為刺激物，分別于刺激0 h、12 h和24 h收集細胞，Western blot技術(shù)檢測PCNA蛋白表達變化；流式細胞術(shù)檢測BrdU陽性細胞百分率。
　　2以100μg.L-1HMGB1刺激MMC，

2、分別于刺激0 min、10 min、30 min、60 min和120 min時收集細胞，Western blot技術(shù)檢測p-PTEN-Ser380、p-PTEN-Ser370、p-S6K-Thr389、S6K蛋白表達。
　　3將常規(guī)培養(yǎng)的 MMC隨機分為對照組（control group）、HMGB1刺激組（ HMGB1 group）、HMGB1+空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（ H+EV）、HMGB1+PTEN非磷酸化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（H+S380

3、A）和HMGB1+PTEN持續(xù)磷酸化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（H+S380D），以 BrdU摻入結(jié)合免疫熒光技術(shù)檢測BrdU表達；免疫細胞化學技術(shù)檢測Ki67蛋白的表達。
　　4將常規(guī)培養(yǎng)的 MMC隨機分為 control group、HMGB1 group和HMGB1+PF-4708671 group,先加入25μmol.L-1的PF-4708671預處理24 h,再更換為含100μg.L-1HMGB1的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育10min、30min

4、和24 h， Western blot技術(shù)檢測p-PTEN-Ser380、p-S6K-Thr389、S6K和PCNA蛋白的表達變化。
　　結(jié)果：
　　1 HMGB1能夠上調(diào)小鼠系膜細胞的增殖水平
　　1.1流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：與HMGB1刺激0 h組相比，HMGB1刺激12 h組 BrdU陽性細胞百分率有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義；而HMGB1刺激24 h時，其陽性細胞百分率明顯增加,差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.0

5、5）。
　　1.2 Western blot結(jié)果顯示：與HMGB1刺激0 h組相比，HMGB1刺激12 h組與HMGB1刺激24 h組PCNA蛋白表達明顯升高，并且HMGB1刺激24 h時PCNA蛋白表達高于HMGB1刺激12 h時，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　2 HMGB1誘導小鼠系膜細胞中 PTEN(Ser380)發(fā)生磷酸化修飾（p-PTEN-Ser380）
　　Western blot結(jié)果顯示：H

6、MGB1刺激10 min時p-PTEN-Ser380水平升高，30 min達高峰，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；隨后降低，120 min時回落至正常水平；而 HMGB1刺激各時間點， PTEN(Ser370)的磷酸化水平（p-PTEN-Ser370）均無明顯變化。
　　3 PTEN(Ser380)的磷酸化參與HMGB1誘導的系膜細胞增殖
　　BrdU摻入法細胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，HMGB1

7、刺激組BrdU陽性細胞百分率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與HMGB1刺激組相比，HMGB1+空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組BrdU陽性細胞百分率無明顯變化，HMGB1+PTEN非磷酸化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組BrdU陽性細胞百分率明顯下降，HMGB1+PTEN持續(xù)磷酸化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組BrdU陽性細胞百分率明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　免疫細胞化學檢測結(jié)果顯示：Ki67陽性信號主要定位于細胞核，與對照組相比，HMGB1刺激組

8、Ki67陽性細胞百分率明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與HMGB1刺激組相比，HMGB1+空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Ki67陽性細胞百分率無明顯變化，HMGB1+PTEN非磷酸化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Ki67陽性細胞百分率明顯下降，而HMGB1+PTEN持續(xù)磷酸化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Ki67陽性細胞百分率明顯上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。4 HMGB1促進小鼠系膜細胞中S6K(Thr389)發(fā)生磷酸化
　　Western blot結(jié)果顯

9、示：與HMGB1刺激0 min組相比，HMGB1刺激10 min后S6K(Thr389)磷酸化水平(p-S6K-Thr389)升高，30 min時有所回落，但仍高于正常對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），60 min和120 min接近正常水平；HMGB1刺激各時間點，總S6K表達無明顯變化。
　　5 PF-4708671能夠抑制HMGB1誘導的小鼠系膜細胞中p-PTEN-Ser380、PCNA、p-S6K-Thr389

10、蛋白的表達
　　Western blot結(jié)果顯示：與對照組相比， HMGB1刺激組中p-PTEN-Ser380、p-S6K-Thr389和 PCNA蛋白表達水平明顯上調(diào)；而與HMGB1刺激組相比， HMGB1+PF-4708671組 p-PTEN-Ser380、p-S6K-Thr389和PCNA蛋白表達水平明顯下降，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1 HMGB1能夠促進小鼠系膜細胞中PTEN(S