MAT1蛋白切割與其調(diào)控的RARα低磷酸化抑制髓性白血病細(xì)胞惡性增殖的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本文對(duì)MAT1蛋白切割與其調(diào)控的RARα低磷酸化抑制髓性白血病細(xì)胞惡性增殖的作用及其機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：MAT1表達(dá)/切割對(duì)正常及惡性造血細(xì)胞增殖/分化的調(diào)控作用及其機(jī)制研究。
　　目的：髓性白血病是一類造血系統(tǒng)的克隆性惡性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明且治療效果有待提高。參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和基因轉(zhuǎn)錄的MAT1蛋白在正常造血干細(xì)胞的粒向分化過程中發(fā)生切割，但其在全反式維甲酸(ATRA)耐藥的髓性白

2、血病細(xì)胞中則以全長形式高表達(dá)，提示MAT1的表達(dá)和切割與正常及惡性造血細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān)，但其調(diào)控機(jī)制尚不明確。本部分研究將以MAT1、正常造血干細(xì)胞和髓性白血病細(xì)胞為研究對(duì)象，系統(tǒng)探討MAT1的表達(dá)和切割對(duì)正常及惡性造血細(xì)胞體內(nèi)外增殖和分化的影響，并闡明相關(guān)作用機(jī)制。
　　方法：本研究采用CD34+細(xì)胞（人源性造血干/祖細(xì)胞）、原代髓性白血病細(xì)胞和可傳代的髓性白血病細(xì)胞株作為研究對(duì)象。血球計(jì)數(shù)板結(jié)合臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目

3、，從而計(jì)算細(xì)胞生存率、死亡率與倍增時(shí)間；采用分子克隆手段構(gòu)建全長MAT1和其切割片段pM9質(zhì)粒，并產(chǎn)出使細(xì)胞過表達(dá)MAT1和pM9的慢病毒；Western Blotting法檢測蛋白的表達(dá)和磷酸化水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞膜表面特異性抗原CD11b、CD66、CD34和CD19的表達(dá)量，或在動(dòng)物模型中檢測表達(dá)GFP熒光蛋白的細(xì)胞比例；qRT-PCR法檢測MAT1、CD11b、CD66等mRNA轉(zhuǎn)錄水平；瑞姬染色檢測細(xì)胞核形態(tài)的改變；免疫熒

4、光法檢測MAT1和p21Cip/Kip蛋白在CD34+細(xì)胞中的表達(dá)量；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測MAT1切割片段的氨基酸序列，以推測MAT1的切割位點(diǎn)；免疫沉淀檢測多種蛋白之間的結(jié)合水平；HE染色和免疫組化染色檢測組織切片中特定蛋白的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的形態(tài)。
　　結(jié)果：(1)MAT1促進(jìn)CD34+細(xì)胞擴(kuò)增并抑制其粒向分化。采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)在CD34+細(xì)胞中過表達(dá)MAT1后，發(fā)現(xiàn)MAT1的過表達(dá)不僅可拮抗內(nèi)源性MAT1的切割降解，并且促

5、進(jìn)了CD34+細(xì)胞的體外擴(kuò)增。與此同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)MAT1抑制細(xì)胞表達(dá)成熟粒細(xì)胞表面標(biāo)記物CD66和CD11b，瑞姬染色也證實(shí)MAT1過表達(dá)可抑制細(xì)胞核在ATRA誘導(dǎo)下出現(xiàn)粒細(xì)胞特異性的分葉狀形變，提示 CD34+細(xì)胞的體外擴(kuò)增和粒向分化受MAT1表達(dá)的調(diào)控。為進(jìn)一步明確MAT1在體內(nèi)對(duì)CD34+細(xì)胞的影響，將人源性間充質(zhì)干細(xì)胞與CD34+細(xì)胞共接種于免疫缺陷的NSG小鼠，從而構(gòu)建適宜CD34+細(xì)胞在體分化的微環(huán)境。通過流式細(xì)胞

6、分選結(jié)合qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)MAT1的過表達(dá)不僅促進(jìn)CD34+細(xì)胞在骨髓內(nèi)的歸巢和在外周血中的擴(kuò)增，而且抑制了細(xì)胞中CD11b和CD66的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，揭示MAT1在體內(nèi)也具有促進(jìn)CD34+細(xì)胞擴(kuò)增并維持其干細(xì)胞特性的作用。由于上述過程伴隨著細(xì)胞周期抑制蛋白p21Cip/Kip表達(dá)量的降低，提示MAT1可能通過下調(diào)p21Cip/Kip的表達(dá)促進(jìn)造血干細(xì)胞擴(kuò)增并且抑制其粒向分化。
　　(2)MAT1的活性切割片段pM9通過調(diào)控CA

7、K和TFIIH活性抑制髓性白血病細(xì)胞的惡性演進(jìn)。采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析全長MAT1和其切割片段M30的氨基酸序列，對(duì)比發(fā)現(xiàn)MAT1在C末端發(fā)生切割，從而產(chǎn)生M30和pM9兩個(gè)片段。經(jīng)分子克隆技術(shù)構(gòu)建Flag標(biāo)記的pM9質(zhì)粒后，采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)在HL60、HL60R和Jurl-MK1三株髓性白血病細(xì)胞中過表達(dá)pM9，發(fā)現(xiàn)pM9不僅可降低內(nèi)源性MAT1的表達(dá)，而且可與內(nèi)源性MAT1競爭性結(jié)合cyclin H和CDK7從而構(gòu)成ΔCAK。

8、由于pM9不具備結(jié)合TFIIH XPD和XPB所需的結(jié)構(gòu)域，ΔCAK無法與TFIIH核心結(jié)合從而構(gòu)成完整的TFIIH激酶，因此pM9形成的ΔCAK能顯著抑制內(nèi)源性CAK和TFIIH的形成。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，pM9可抑制原代AML細(xì)胞和髓性白血病細(xì)胞株的體外增殖并促進(jìn)原代細(xì)胞的粒向分化。WesternBlotting結(jié)合qRT-PCR結(jié)果顯示，上述作用可能是通過降低CDK7的磷酸化從而抑制CAK對(duì)下游蛋白CDK1和RARα的磷酸化激活，并且

9、干預(yù)TFIIH介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)的。但pM9的上述抑制作用僅局限于髓性白血病細(xì)胞，而對(duì)正常造血干細(xì)胞的擴(kuò)增無明顯影響，造成其敏感性差異的原因可能是 pM9對(duì)RNA PolⅡ磷酸化水平的調(diào)控，以上結(jié)果提示pM9具有良好的腫瘤靶向性。在NSG小鼠白血病移植瘤模型中，pM9可模擬ATRA介導(dǎo)的MAT1切割，抑制ATRA耐受的髓性白血病細(xì)胞在體內(nèi)的增殖與轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論：MAT1的表達(dá)促進(jìn)造血干細(xì)胞的擴(kuò)增并抑制其粒向分化，而MAT1的活

10、性切割片段pM9可模擬MAT1的切割并形成ΔCAK，從而影響內(nèi)源性CAK和TFIIH的形成與活性，最終特異性地抑制髓性白血病細(xì)胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移。
　　第二部分：基于低磷酸化RARαS77抑制ATRA耐藥的t(8;21)AML細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的抗白血病增殖作用機(jī)制研究。
　　目的：非APL的急性髓性白血病(AML)細(xì)胞中的CAK-RARα信號(hào)通路阻滯是患者對(duì)ATRA分化療法不敏感的原因之一。第一部分研究已經(jīng)證實(shí)了MAT1的活性切

11、割片段pM9可形成ΔCAK，從而減少內(nèi)源性CAK對(duì)RARα的磷酸化并抑制髓性白血病細(xì)胞的惡性增殖與轉(zhuǎn)移。在本部分研究中，將以ATRA耐藥的t(8;21)AML為研究對(duì)象，考察RARα的磷酸化水平對(duì)基因轉(zhuǎn)錄與細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)而探討RARα的磷酸化與白血病細(xì)胞耐受ATRA之間的相關(guān)性和分子機(jī)制，為設(shè)計(jì)基于干預(yù)RARα磷酸化的全新抗白血病藥物提供思路及潛在靶點(diǎn)。
　　方法：采用原代t(8;21)AML細(xì)胞和可傳代的t(8;21)AML

12、細(xì)胞株作為研究對(duì)象。采用分子克隆手段構(gòu)建Flag標(biāo)記的RARα和RARαS77A質(zhì)粒，并產(chǎn)出使細(xì)胞過表達(dá)RARα和RARαS77A的慢病毒；血球計(jì)數(shù)板結(jié)合臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目，從而計(jì)算細(xì)胞生存率和死亡率；DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡時(shí)的核小體片段；Western Blotting法檢測蛋白的表達(dá)和磷酸化水平；qRT-PCR法檢測mRNA的轉(zhuǎn)錄水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和表達(dá)GFP熒光蛋白的細(xì)胞比例；免疫沉淀檢測多種蛋白之間的結(jié)

13、合水平；HE染色和免疫組化染色檢測組織切片中特定蛋白的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的形態(tài)；染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合qPCR分析特定蛋白對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄的影響。
　　結(jié)果：持續(xù)低磷酸化的RARαS77突變體RARαS77A在多種髓性白血病細(xì)胞中的過表達(dá)可促進(jìn)多種與細(xì)胞分化和凋亡相關(guān)的RA靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制細(xì)胞的體外增殖并誘導(dǎo)ATRA耐受的t(8;21)AML細(xì)胞株發(fā)生凋亡，而合用ATRA可進(jìn)一步增強(qiáng)RARαS77A誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。在去除培養(yǎng)體系中的維

14、甲酸或給予靶向RARα配體結(jié)合域的RARα抑制劑Ro41-5253后，發(fā)現(xiàn)RARαS77A引起的細(xì)胞增殖抑制和促RA靶基因轉(zhuǎn)錄的作用未受影響。以上結(jié)果在原代t(8;21)AML細(xì)胞中也得到證實(shí)，提示RARαS77A的作用不依賴于配體作用以及RARα配體結(jié)合域的激活。將過表達(dá)RARαS77A的t(8;21)AML細(xì)胞株SKNO-1接種于免疫缺陷的NSG小鼠中，或同時(shí)給予ATRA后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓和外周血中SKNO-1細(xì)胞的比例，發(fā)

15、現(xiàn)與空白載體組相比，RARαS77A單獨(dú)或與ATRA合用均能顯著抑制SKNO-1細(xì)胞在骨髓和外周血中的增殖，并且抑制細(xì)胞向淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步闡明低磷酸化的RARαS77是如何調(diào)控RA靶基因轉(zhuǎn)錄從而抑制 t(8;21)AML細(xì)胞增殖，采用染色質(zhì)免疫共沉淀法檢測RARαS77A、RARα、RNA PolⅡ和ETO等蛋白與RA靶基因RARE區(qū)域的結(jié)合。結(jié)果顯示，RARβ2等RA靶基因的轉(zhuǎn)錄激活伴隨著RARαS77A與靶基因RARE區(qū)域結(jié)