EZH2調(diào)控急性髓系白血病細(xì)胞髓外浸潤及其分子機制研究.pdf

1、目的：
　　急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是血液系統(tǒng)的惡性腫瘤之一，白血病細(xì)胞在骨髓中無限增殖和向髓外組織浸潤，死亡率非常高，盡管近年來化療方案的不斷改進(jìn)提高了白血病的誘導(dǎo)緩解率，但其復(fù)發(fā)率仍較高。其中的原因之一是白血病髓外浸潤。
　　初診AML患者有30～40％可伴有髓外浸潤(extramedullary infiltration，EMI)，主要臨床表現(xiàn)為淋巴結(jié)腫大、齒齦增生、皮膚浸

2、潤、肝脾腫大及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的侵犯等[1]。有文獻(xiàn)顯示EMI在M4和M5類型(FAB) AML中的發(fā)生率較其他類型高，且伴有EMI的AML患者往往預(yù)后較差[2-4]，特別是在伴有t(8;21)異常核型的AML患者[5]。
　　作為PRC2催化活性亞基，果蠅zeste基因增強子的人類同源基因2(enhancer ofzestehomolog2，EZH2)，起組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的作用。它主要通過對核小體組蛋白H3K27位點賴氨酸進(jìn)行甲基化

3、修飾[6-8]，從而沉默抑癌基因、周期蛋白等基因的表達(dá)來參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及腫瘤的形成[6，9，10]。大量的研究顯示EZH2在多種惡性實體腫瘤如前列腺癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、腎癌、大腸癌過表達(dá)，而且與腫瘤的侵襲性及較差預(yù)后相關(guān)[11-17]。目前的研究顯示EZH2在高危的MDS及由其轉(zhuǎn)化而來的AML中過表達(dá)與較差預(yù)后相關(guān)[18]，還有研究報道EZH2蛋白在AML患者中的高表達(dá)與LDH異常升高、WBC≥50×109及較差預(yù)后

4、顯著相關(guān)[19]。
　　本課題組研究發(fā)現(xiàn)AML患者EZH2的表達(dá)水平明顯高于正常對照組，且EZH2 mRNA的表達(dá)與外周白血病細(xì)胞比例顯著正相關(guān)。在不同細(xì)胞株中，U937和KG-1α細(xì)胞的EZH2基因和蛋白表達(dá)水平均顯著低于Kasumi-1和HL60細(xì)胞(P＜0.05)，同時前兩種細(xì)胞的遷移能力也明顯弱于后兩種細(xì)胞[20,21]。
　　我們推測EZH2在AML中可能與白血病細(xì)胞EMI有關(guān)。然而EZH2在AML是否參與EMI的

5、過程及其作用機制如何，目前尚乏研究。為了進(jìn)一步探究在AML中EZH2與EMI的關(guān)系，我們選取高表達(dá)EZH2的白血病細(xì)胞株kasumi-1作為研究對象，構(gòu)建干擾EZH2表達(dá)的載有shRNA的慢病毒載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染kasumi-1細(xì)胞，敲除EZH2觀察其增殖、凋亡及遷移等生物學(xué)功能的變化并進(jìn)一步探究EZH2基因影響白血病細(xì)胞EMI可能的機制。為防治白血病髓外浸潤的發(fā)生發(fā)展和治療方法提供理論依據(jù)。
　　對象與方法：
　　1 構(gòu)建質(zhì)粒

6、載體，包裝病毒轉(zhuǎn)染kasumi-1細(xì)胞
　　基于siRNA設(shè)計原則，針對EZH2基因轉(zhuǎn)錄本共同區(qū)域中的3個靶點我們設(shè)計3條shRNA序列(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)。構(gòu)建干擾EZH2的shRNA慢病毒載體，將慢病毒轉(zhuǎn)染白血病細(xì)胞株kasum-1，達(dá)到穩(wěn)定干擾下調(diào)EZH2的目的。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染慢病毒后細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果并分選出GFP陽性細(xì)胞用于體外擴(kuò)增培養(yǎng)。隨后用QRT-PCR(quantity rever

7、se transcription PCR)和Western Blot(WB)技術(shù)檢測3種shRNAs(siRNA-1、siRNA-2及siRNA-3)對EZH2的干擾效果，選取干擾效果最好的細(xì)胞作為siEZH2實驗組用于后續(xù)實驗研究。
　　2 EZH2對kasumi-1細(xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　實驗中將野生型kasumi-1細(xì)胞定義為wild組，轉(zhuǎn)染陰性對照序列的kasumi-1細(xì)胞定義為NC組，轉(zhuǎn)染干擾EZH2基因序列的k

8、asumi-1細(xì)胞定義為siEZH2組。隨后分別應(yīng)用熒光定量PCR和Western-Blot檢測上述三組細(xì)胞EZH2 mRNA和蛋白的表達(dá)，驗證干擾效果。應(yīng)用CCK8檢測上述三組細(xì)胞的增殖活性，運用流式細(xì)胞術(shù)檢測三組細(xì)胞的凋亡，并運用transwele小室細(xì)胞遷移實驗檢測三組細(xì)胞的遷移能力。
　　3 探究EZH2影響kasumi-1細(xì)胞遷移可能的機制
　　結(jié)合參考文獻(xiàn)，運用WB檢測細(xì)胞遷移相關(guān)信號通路蛋白，如ERK、p-ER

9、K、c-myc、 MMP-2、E-cadherin等的表達(dá)，以探究在白血病中EZH2參與EMI可能的分子機制。
　　4 統(tǒng)計分析方法
　　運用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以(x)±s描述資料數(shù)據(jù)，三組細(xì)胞EZH2 mRNA的比較采用單因素方差分析(One way ANOVA)，以P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。Levene檢驗方差齊性，P＜0.05則方差齊，運用LSD方法方法進(jìn)行三組中兩兩比較;P＞0.05則方差

10、不齊，則用采用近似F檢驗(Welch方法)代替方差分析后用Dunnett'S T3方法進(jìn)行三組中兩兩比較.
　　結(jié)果：
　　1 構(gòu)建質(zhì)粒載體，包裝病毒轉(zhuǎn)染kasumi-1細(xì)胞
　　根據(jù)RNAi設(shè)計原則，針對EZH2基因的3個靶點設(shè)計了3條shRNA序列，將這些序列合成Oligo，連接到相應(yīng)載體。將載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，提取質(zhì)粒，測序驗證。測序結(jié)果表明:上述三種重組載體質(zhì)粒pGFP-shEZH2中shRNA序列與設(shè)計的s

11、hRNA序列相符，且正確插入到pGFP病毒載體中，可用于后續(xù)實驗。將包裝好的慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下觀轉(zhuǎn)染色48h后kasumi-1細(xì)胞熒光表達(dá)情況，可見熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少。用上述設(shè)計好的病毒轉(zhuǎn)染的kasumi-1細(xì)胞，72小時在熒光顯微鏡下拍照可見帶有綠色熒光的ksaumi-1。運用流式細(xì)胞術(shù)檢測三個不同序列siRNA及空病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率。其中siRNA-1組的轉(zhuǎn)染率為77.12％，siRNA-

12、2組的轉(zhuǎn)染率為48.78％，siRNA-3組的轉(zhuǎn)染率為71.72％，NC組的轉(zhuǎn)染率為76.41％。隨后應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)從四組中篩選出GFP陽性細(xì)胞，體外擴(kuò)增培養(yǎng)后用于后續(xù)試驗。
　　我們用QRT-PCR及WB驗證了三個不同序列敲除EZH2的效果。siRNA-3組EZH2 mRNA的表達(dá)水平為（0.0070±0.0002），siRNA-1組為(0.0096±0.0004)，siRNA-2組為（0.0285±0.0031）。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)

13、現(xiàn)其中siRNA-3(GGATAGAGAATGTGGGTTT)序列下調(diào)kasumi-1細(xì)胞EZH2的表達(dá)最為顯著，WB結(jié)果也顯示siRNA-3組下調(diào)效果最明顯，檢測結(jié)果顯示與mRNA一致。因此以siRNA-3組作為siEHZ2組。此外，我們進(jìn)一步用QRT-PCR和WB檢測了wild組、NC組以及siEZH2組三組之間EZH2的表達(dá)水平。siEZH2組EZH2 mRNA的表達(dá)水平為(0.0071±0.0002;P＜0.05)，明顯低于wi

14、ld組(0.1243±0.0074)和NC組(0.1147±0.0091)的水平，P均小于0.000，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而wild組與NC組之間比較P=0.135，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，WB結(jié)果與PCR結(jié)果一致，siEZH2組細(xì)胞可用于后續(xù)試驗。
　　2 穩(wěn)定下調(diào)EZH2對kasumi-1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　2.1 下調(diào)EZH2對kasumi-1細(xì)胞的增殖的影響
　　我們應(yīng)用CCK-8法檢測wild組，NC組及si

15、EZH2組三組細(xì)胞的增殖力。觀察0h,24h,48h,72h以及96h三組細(xì)胞的OD情況，結(jié)果顯示siEZH2組OD值在0h和其他兩組比較接近，此后的四個時間點的OD值均小于其他兩組。以時間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活力為縱坐標(biāo)作圖，發(fā)現(xiàn)siEZH2組細(xì)胞存活力明顯低于其他兩組(P＜0.05)。說明下調(diào)EZH2后細(xì)胞的增殖存活能力下降了。
　　2.2 下調(diào)EZH2對kasumi-1細(xì)胞凋亡的影響。
　　本研究中我們運用流式細(xì)胞術(shù)檢測三

16、組細(xì)胞的凋亡能力。流式結(jié)果顯示siEZH2組細(xì)胞早期凋亡為（6.23±0.38）％，顯著高于wild組(3.14±0.37)％及NC組(2.90±0.33)％，P值均為0.001，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;siEZH2的晚期凋亡為（20.77±1.15）％，也顯著高于wild組（3.77±0.36）％及NC組（4.70±0.85）％，P值分別為0.001及0.000，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明下調(diào)EZH2 kasumi-1細(xì)胞的凋亡增加了。

17、r>　　2.3 下調(diào)EZH2對kasumi-1細(xì)胞遷移能力的影響。
　　我們應(yīng)用transwele小室遷移實驗檢測三組細(xì)胞的遷移能力。實驗中我們觀察18h遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，我們發(fā)現(xiàn)siEZH2組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)為[（3.50±0.25）％]比wild組[（9.08±0.38）％]和NC組[（9.17±0.38）％]顯著降低，P值均為0.000;蘇木素染色后我們發(fā)現(xiàn)siEZH2組膜上細(xì)胞基數(shù)（26.67±1.53）顯著低于wi

18、ld組(73.33±3.51)和NC組(72.00±3.00)，p值分別為0.000，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。小室遷移實驗結(jié)果說明下調(diào)EZH2后kasumi-1細(xì)胞的遷移能力也隨之下降。從而說明了EZH2可能與白血病細(xì)胞的遷移(EMI)相關(guān)。
　　3 EZH2表達(dá)調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞遷移的機制
　　為了進(jìn)一步了解EZH2調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞遷移的作用機制，我們應(yīng)用WB檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果提示下調(diào)EZH2后EZH2發(fā)揮作用密切相關(guān)的蛋白H

19、3K27me3表達(dá)量顯著減少，相關(guān)的蛋白p-ERK，p-cmyc及MMP-2表達(dá)量均顯著減少，而與遷移密切相關(guān)的鈣黏連蛋白(E-cadherin)表達(dá)量則明顯上調(diào)。ERK，c-myc及APP的表達(dá)則基本不變。因此我們EZH2推測EZH2可能通過p-ERK/p-cmyc/MMP2信號通路及E-cadherin影響kasumi-1細(xì)胞的遷移能力.
　　結(jié)論：
　　1 siRNA慢病毒可穩(wěn)定下調(diào)EZH2的表達(dá)，并通過慢病毒細(xì)胞轉(zhuǎn)染