胞外HMGB1在ALD-DNA誘導巨噬細胞活化中的作用及其機制.pdf

1、目的:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種典型的自身免疫性疾病，其病變特征包括患者血清中出現(xiàn)高水平的針對自身核抗原產(chǎn)生的自身抗體。目前SLE的發(fā)病機制仍未完全明確，與多種因素有關(guān)。正常情況下，哺乳動物DNA等核成分的免疫原性很弱，難以誘導自身抗體產(chǎn)生，因而闡明自身DNA如何打破免疫耐受激活免疫系統(tǒng)是研究SLE發(fā)病機制的重點。
　　我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)與正常淋巴細胞來源的DNA(

2、UnALD-DNA)相比，用ConA活化的淋巴細胞來源的DNA(ALD-DNA)免疫同系BALB/c小鼠可以誘導抗dsDNA抗體的產(chǎn)生，高水平尿蛋白等SLE樣綜合征的發(fā)生;進一步研究發(fā)現(xiàn):ALD-DNA可以有效活化免疫細胞，尤其是巨噬細胞，分泌大量炎性細胞因子，其中巨噬細胞是參與天然免疫的重要細胞，同時也是一類專職APC，在天然免疫應答和適應性免疫應答過程中均發(fā)揮著重要作用。但是ALD-DNA是如何被巨噬細胞識別，進而活化巨噬細胞的，其

3、具體機制還有待進一步研究。
　　高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)是高遷移率族蛋白(HMG)家族成員之一，因在聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中遷移率高而得名。它廣泛存在于真核細胞內(nèi)，能夠調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定核小體的結(jié)構(gòu)以及釋放后具有炎癥介質(zhì)功能的核蛋白，是一種重要的與損傷相關(guān)的分子識別模式(damageassociated molecular patterns，DA

4、MPs)。靜息條件下，HMGB1存在于細胞核內(nèi)，當機體受到一定刺激時，核內(nèi)的HMGB1可通過活化的免疫細胞如巨噬細胞或單核細胞的主動分泌和壞死細胞的被動釋放轉(zhuǎn)移至細胞外。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1能夠結(jié)合多種核酸成分，進而活化下游特異性核酸受體，誘導巨噬細胞分泌大量炎性因子，在機體免疫系統(tǒng)對核酸成分應答的過程中可能扮演著重要角色。近年來有研究顯示HMGB1可以激活和趨化炎癥細胞，誘導大量細胞因子的分泌，被認為是一種新型的炎性介質(zhì)，正引起國內(nèi)外

5、學者的廣泛關(guān)注。
　　前期我們實驗室研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在ALD-DNA誘導巨噬細胞活化中扮演一定的角色，但是HMGB1是如何增強巨噬細胞對ALD-DNA的識別，加重炎癥反應，并且胞漿還是分泌到胞外的HMGB1對ALD-DNA識別、攝取及細胞內(nèi)的運輸?shù)扔绊懯窃鯓拥纳胁磺宄?。在本研究中，我們重點探討了胞外還是胞內(nèi)的HMGB1在ALD-DNA誘導巨噬細胞活化中的作用機制，即HMGB1介導ALD-DNA刺激巨噬細胞活化的形式、位置及其機制

6、。這一研究不僅有助于我們更好地解釋HMGB1促進ALD-DNA誘導巨噬細胞活化的機制，而且為闡明SLE的發(fā)病機理提供了更堅實的理論依據(jù)，有利于為SLE的防治策略尋找到新的靶點。
　　方法:首先用ALD-DNA刺激RAW264.7巨噬細胞系后，用Western blot和ELISA的方法檢測細胞以及上清中HMGB1的表達情況。含有HMGB1-shRNA的慢病毒載體經(jīng)293 T細胞包裝病毒后，感染RAW264.7，Real-time和

7、Western blot評估HMGB1下調(diào)效率。ALD-DNA刺激上述HMGB1穩(wěn)定下調(diào)的巨噬細胞(HMGB1KD RAW264.7)及正常RAW264.7，流式細胞術(shù)檢測細胞表面協(xié)同刺激分子表達水平，Real-time檢測細胞內(nèi)IL-6，IL-10，TNF-α mRNA表達情況，以評估HMGB1在ALD-DNA誘導巨噬細胞活化中的作用。用丙酮酸乙酯抑制HMGB1分泌出細胞外，HMGB1拮抗劑A盒肽和HMGB1特異性中和抗體等處理細胞后

8、，ELISA和Real-time的方法檢測炎性細胞因子的表達情況，同時我們給予正常RAW264.7和HMGB1KD RAW264.7細胞外源HMGB1蛋白時，檢測了炎性細胞因子的表達情況，以評估胞外HMGB1在ALD-DNA刺激巨噬細胞活化中的作用。最后我們探討了HMGB1介導ALD-DNA誘導巨噬細胞活化的機制，首先用間接競爭性ELISA的方法HMGB1與ALD-DNA或UnALD-DNA的相互作用及結(jié)合親和力的差異;隨后通過流式細胞

9、術(shù)檢測了HMGB1對巨噬細胞吞噬ALD-DNA或UnALD-DNA的影響;最后用激光共聚焦熒光顯微鏡觀測了HMGB1對ALD-DNA或UnALD-DNA進入細胞后囊泡運輸間的影響。
　　結(jié)果:ALD-DNA可以有效刺激巨噬細胞活化，HMGB1分泌顯著增加，并且呈現(xiàn)時間劑量依賴性;HMGB1-shRNA特異性下調(diào)HMGB1效果明顯，下調(diào)效率達到1/5，可以用于后續(xù)實驗;當巨噬細胞中HMGB1下調(diào)后，其分泌HMGB1的能力減弱，同時A

10、LD-DNA誘導巨噬細胞表面協(xié)同刺激分子、MHC-Ⅱ類分子表達下降，炎性細胞因子mRNA表達顯著減少，巨噬細胞活化程度降低。丙酮酸乙酯阻止巨噬細胞受ALD-DNA刺激后HMGB1的分泌，HMGB1在胞質(zhì)中大量積累，細胞上清中炎性細胞因子的含量顯著減少;HMGB1拮抗劑A盒肽和HMGB1特異性中和抗體處理細胞后，發(fā)現(xiàn)ALD-DNA刺激巨噬細胞分泌的炎性細胞因子含量也顯著降低;同時給予正常RAW264.7以及HMGB1KD RAW264.7

11、外源HMGB1蛋白時發(fā)現(xiàn)HMGB1可以增強ALD-DNA刺激正常RAW264.7分泌更多的炎性細胞因子，并且ALD-DNA刺激HMGB1KD RAW264.7分泌炎性細胞因子的能力在加入外源HMGB1后得到一定程度的恢復。競爭性間接ELISA的結(jié)果表明HMGB1可以與ALD-DNA和UnALD-DNA結(jié)合，但是與ALD-DNA的結(jié)合親和力顯著高于UnALD-DNA;HMGB1對巨噬細胞攝取不同DNA沒有顯著影響;激光共聚焦的結(jié)果顯示HM

12、GB1可以顯著增加ALD-DNA在內(nèi)體上的定位，并且加速了ALD-DNA在內(nèi)體上的募集。
　　結(jié)論:ALD-DNA可以有效刺激巨噬細胞分泌HMGB1，并且這一過程具有時間劑量依賴性。HMGB1在ALD-DNA誘導巨噬細胞活化中具有重要作用，且胞外HMGB1在其中扮演關(guān)鍵角色。HMGB1可以有效與ALD-DNA結(jié)合，加速和增加了其在巨噬細胞內(nèi)早期內(nèi)體上的募集，從而促進了ALD-DNA誘導巨噬細胞活化，介導SLE的病理發(fā)展。該研究進一