HMGB1對Th17細(xì)胞的誘導(dǎo)及其在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中作用機(jī)制的初步探討.pdf

1、目的：克隆并鑒定鼠HMGB1基因；原核表達(dá)HMGB1蛋白，制備多克隆抗體；檢測類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血中高遷移率族蛋白1(highmobility group box chromosomal protein1，HMGB1)及Th17主要轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，分析HMGB1、Th17細(xì)胞相關(guān)因子及某些臨床檢驗(yàn)指標(biāo)之間的相關(guān)性；通過體外HMGB1對Th17細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，初步探討HMGB1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中可能的作用機(jī)制。

2、>　　 方法：
　　 1)采用RT-PCR方法從小鼠脾臟細(xì)胞獲得HMGB1基因全長，克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α宿主菌，挑取菌落進(jìn)行進(jìn)行單、雙酶切鑒定及序列分析。
　　 2)將HMGB1基因克隆到pET28原核表達(dá)載體，在大腸埃希菌Rossta中表達(dá)，獲得帶有His標(biāo)簽的30KD左右的HMGB1融合蛋白；利用Bio-Rad公司的IMAC柱純化HMGB1蛋白；用抗-His抗體對HMGB1融合蛋白進(jìn)

3、行Westernblot鑒定。以HMGB1蛋白作為抗原免疫家兔，收集含抗HMGB1多克隆抗體的兔血清，并用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法鑒定抗體的效價(jià)。
　　 3)收集江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院-鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院門診80例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)患者外周血標(biāo)本，其中靜止期32例、活動期48例，健康志愿者50例。
　　 4)HMGB1與小鼠CD4+T細(xì)胞的共培養(yǎng)。
　　 5)采用實(shí)時(shí)熒

4、光定量PCR(QRT-PCR)及ELISA檢測標(biāo)本PBMC中HMGB1及Th17相關(guān)因子的表達(dá)水平。
　　 6)采用流式分析(FACS)法檢測標(biāo)本中CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞的比率。
　　 結(jié)果：
　　 1.鼠HMGB1基因克隆，表達(dá)及多克隆抗體制備結(jié)果
　　 1)成功克隆了包括648bp編碼區(qū)的鼠HMGB1基因全長，與Genebank中發(fā)表的序列完全一致。
　　 2)在大腸埃希菌經(jīng)誘導(dǎo)和純

5、化獲得HMGB1融合蛋白，大小約為30KD。
　　 3)成功制備了針對鼠HMGB1蛋白的多克隆抗體，經(jīng)ELISA和Western blot鑒定，具有良好的反應(yīng)性，也表明融合蛋白具有良好的免疫原性。
　　 2.RA病人相關(guān)檢測分析結(jié)果
　　 1)QRT-PCR分析結(jié)果顯示：與健康對照組比較，RA患者組PBMC中HMGB1及Th17細(xì)胞的主要轉(zhuǎn)錄因子RORrγt和相關(guān)的細(xì)胞因子IL-17 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P

6、＜0.05)；活動期RA患者高于靜止期患者表達(dá)水平(P＜0.05)。相關(guān)性分析表明，RA患者HMGB1與Th17細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)水平有明顯相關(guān)性。
　　 2)ELISA檢測結(jié)果顯示：RA患者血漿IL-17、IL-23呈高表達(dá)，與健康對照組差異明顯(P＜0.05)。
　　 3)流式分析結(jié)果顯示：RA患者CD3+CD8-IL17+T細(xì)胞比率部分明顯高于健康對照組。
　　 3.HMGB1體外誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果<

7、br>　　 HMGB1刺激小鼠CD4+T細(xì)胞結(jié)果顯示：HMGB1對Th17的誘導(dǎo)呈現(xiàn)時(shí)間劑量效應(yīng)，在濃度為100ng/ml作用12h對Th17細(xì)胞有最佳的誘導(dǎo)效果。
　　 結(jié)論：
　　 獲得了鼠HMGB1基因克隆并制備和純化了鼠HMGB1蛋白及多克隆抗體；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者PBMC中HMGB1和Th17細(xì)胞的表達(dá)水平高于健康者，且RA患者HMGB1的表達(dá)與Th17細(xì)胞相關(guān)因子及臨床檢測指標(biāo)的表達(dá)均呈現(xiàn)正相關(guān)，說明HMG