Ndrg2在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的作用初步研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RheumatoidArthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)慢性炎癥和結(jié)構(gòu)破壞為主要表現(xiàn)的全身性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前仍沒(méi)有治療RA的特效藥物。在RA的整個(gè)病程中，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞是主要受損細(xì)胞，也是破壞關(guān)節(jié)的主要效應(yīng)細(xì)胞：該細(xì)胞的異常增生，將侵蝕周?chē)募‰?、韌帶、關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨，造成關(guān)節(jié)進(jìn)行性損傷；過(guò)度增殖的滑膜細(xì)胞所分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶，加速關(guān)節(jié)軟骨的破壞?；ぜ?xì)胞中的NF-κB通路廣泛參與了RA的發(fā)生和進(jìn)

2、展。NF-κB在RA中可以增強(qiáng)滑膜細(xì)胞中細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，降低凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平，最終抑制滑膜細(xì)胞凋亡。NDRG2基因是本室于1999年從正常成人全腦cDNA文庫(kù)中最先發(fā)現(xiàn)并克隆得到的。該基因在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)降低，并可能作為一種抑癌基因參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能。而RA病變部位異常增生的滑膜細(xì)胞在某種程度上具有腫瘤細(xì)胞的特征，因此我們推測(cè)，在異常增生的滑膜細(xì)胞中，NDRG2基因的表達(dá)水平可能也會(huì)降低。在RA滑膜細(xì)胞中，TNF

3、-α可以激活NF-κB通路，抑制RA滑膜細(xì)胞凋亡，而在NDRG2基因上游的啟動(dòng)子區(qū)域含有一個(gè)可能的NF-κB結(jié)合序列，所以我們提出假設(shè)：在RA滑膜細(xì)胞中，TNF-α可能通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控NDRG2基因的表達(dá)，最終抑制RA滑膜細(xì)胞的凋亡過(guò)程。 在第一部分實(shí)驗(yàn)中，我們構(gòu)建了p65和IκBα基因編碼區(qū)的真核表達(dá)載體，并分別在MH7a細(xì)胞(永生化人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維樣細(xì)胞)和HEK293細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞)中驗(yàn)證其

4、表達(dá)，為將來(lái)研究NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在RA滑膜細(xì)胞生物學(xué)特性改變過(guò)程中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 在第二部分的實(shí)驗(yàn)中，我們以HEK293細(xì)胞為對(duì)照，觀察了MH7a細(xì)胞在受到TNF-α刺激后細(xì)胞中Ndrg2蛋白水平的變化。 首先，用30ng/mL的重組人TNF-α刺激MH7a和HEK293細(xì)胞，在刺激后的不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中NF-κB通路的活化情況。結(jié)果顯示，TNF-α刺激可以降低MH7a細(xì)胞中IκBα蛋白水平，使H

5、EK293細(xì)胞中部分IκBα蛋白被磷酸化。這說(shuō)明30ng/mLTNF-α刺激可以有效的激活體外培養(yǎng)的永生化人滑膜細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞中的NF-κB通路。這與文獻(xiàn)報(bào)道的相一致。 接著，我們用不同劑量的TNF-α刺激HEK293細(xì)胞，于刺激后的12h收集細(xì)胞并裂解，Westernblotting檢測(cè)細(xì)胞中Ndrg2蛋白含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNF-α刺激使HEK293細(xì)胞中Ndrg2蛋白水平上調(diào)，并且這一效應(yīng)具有TNF-α劑量依賴性。這一結(jié)果

6、間接說(shuō)明NF-κB可能參與調(diào)控HEK293細(xì)胞中NDRG2基因的表達(dá)。 最后，用TNF-α刺激MH7a細(xì)胞，Westernblotting檢測(cè)MH7a細(xì)胞中Ndrg2蛋白水平，結(jié)果顯示，TNF-α刺激可以降低MH7a細(xì)胞中Ndrg2蛋白水平，并且這一效應(yīng)有一定的TNF-α劑量依賴性和作用時(shí)間依賴性。這一結(jié)果也說(shuō)明NF-κB可能參與調(diào)控MH7a細(xì)胞中NDRG2基因的表達(dá)。 通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，我們可以初步得出結(jié)論：在永生化人類風(fēng)