MicroRNA-21參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者Th17-Treg細(xì)胞失衡的作用與機(jī)制.pdf

1、目的:
　　Th17細(xì)胞(T helper cell17，Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cell，Treg)失衡參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)患者的發(fā)病，但其致病機(jī)理未明。本研究探討類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs)中miR-21的表達(dá)與Th17/Treg平衡的關(guān)系及其調(diào)控機(jī)理。
　　方

2、法:
　　1)流式細(xì)胞技術(shù)分析RA患者及健康對(duì)照者PBMCs中Th17及Treg細(xì)胞的比例。
　　2) RA患者及健康對(duì)照者PBMCs經(jīng)PHA、LPS刺激后FlowCytomix分析細(xì)胞上清液中IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α、 IFN-γ、IL-22和IL-10的表達(dá)，real-time PCR檢測(cè)IL-23、IL-12p35mRNA的表達(dá)。
　　3)磁珠分選RA患者及健康對(duì)照者CD4+T細(xì)胞，real-

3、time PCR檢測(cè)PBMCs、CD4+T細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，Spearman分析PBMCs中miR-21的表達(dá)與Th17/Treg比率的相關(guān)性。
　　4)構(gòu)建高表達(dá)miR-21(LV-miR-21)及其抑制性Sponge慢病毒載體(miR-21 Sponge)，感染THP-1細(xì)胞，real-time檢測(cè)miR-21、Stat3、Stat5a、Stat5b mRNA的表達(dá)，Western blotting檢測(cè)STAT3、ST

4、AT5蛋白表達(dá)。
　　5) real-time PCR檢測(cè)RA患者及健康對(duì)照者PBMCs中Stat3、Stat5a、Stat5b、RORγt、Foxp3 mRNA的表達(dá)，Western blotting技術(shù)分析 STAT3、STAT5、p-STAT3、p-STAT5蛋白的表達(dá);Spearman分析RA患者miR-21與Stat3、Stat5a、Stat5b mRNA表達(dá)的相關(guān)性。
　　6) LPS刺激RA患者及健康對(duì)照者PB

5、MCs，Western blotting技術(shù)檢測(cè)p-STAT3的表達(dá)，real-time PCR檢測(cè)miR-21的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1)與健康對(duì)照者相比，RA患者PBMCs中Th17細(xì)胞比例顯著升高，Treg細(xì)胞比例顯著降低（均P＜0.05）。
　　2)與健康對(duì)照者相比，RA患者PBMCs經(jīng)PHA刺激后，IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α分泌顯著增加（均P＜0.05），IFN-γ水平顯著下降(P＜0.0

6、5)，IL-10表達(dá)無變化;RA患者的PBMCs經(jīng)LPS刺激后，IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-22分泌及IL-23、IL-12p35 mRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng)（均P＜0.05），IL-10表達(dá)無變化。
　　3)與健康對(duì)照者相比，RA患者PBMCs、CD4+T細(xì)胞中miR-21的表達(dá)顯著降低（均P＜0.05），且RA患者PBMCs中miR-21的表達(dá)與其Th17/Treg細(xì)胞比率呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01)。
　　4)

7、與control組相比，THP-1細(xì)胞感染LV-miR-21慢病毒后，miR-21表達(dá)顯著升高(P＜0.001)，Stat3 mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，STAT3蛋白表達(dá)下調(diào)，Stat5a、Stat5b mRNA表達(dá)無明顯改變，STAT5蛋白表達(dá)上調(diào);THP-1細(xì)胞感染miR-21 Sponge慢病毒后，miR-21表達(dá)無明顯改變，Stat3 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.01）STAT3蛋白表達(dá)上調(diào)，Stat5a, Sta

8、t5b mRNA表達(dá)無明顯改變，STAT5蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　5)與健康對(duì)照者相比，RA患者PBMCs中Stat5a、Stat5b mRNA的表達(dá)顯著降低（均P＜0.05）;RA患者PBMCs中STAT3、p-STAT3的表達(dá)上調(diào)，STAT5、p-STAT5的表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)oxp3mRNA表達(dá)顯著減少(P＜0.05);且RA患者PBMCs中miR-21表達(dá)與Stat3mRNA的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與Stat5a、Sta

9、t5b mRNA的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（均P＜0.01）。
　　6)RA患者及健康對(duì)照者PBMCs經(jīng)LPS刺激后，p-STAT3表達(dá)均上調(diào)，但僅健康對(duì)照者PBMCs中miR-21表達(dá)增加(P＜0.01)，RA患者PBMCs中miR-21表達(dá)減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1) RA患者確實(shí)存在Th17/Treg細(xì)胞失衡，RA患者Th17/Treg細(xì)胞失衡可能與IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-22

10、、IL-23等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)相關(guān)。
　　2)RA患者miR-21的表達(dá)與其Th17/Treg細(xì)胞失衡密切相關(guān)，且與Th17、Treg細(xì)胞發(fā)育分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子STAT3、STAT5的表達(dá)密切相關(guān)，miR-21可能通過Stat3/stat5參與RA患者Th17/Treg細(xì)胞失衡。
　　3)正常情況下，LPS刺激誘導(dǎo)STAT3活化，也可促使miR-21的表達(dá)，但不能誘導(dǎo)RA患者miR-21的表達(dá);因而，正常情況下，miR-21