HMGB1誘導EAM小鼠MΦ極化的機制研究.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建實驗性自身免疫性心肌炎小鼠模型，觀察HMGB1對心肌組織巨噬細胞浸潤和極化的影響，體外對其分子機制進行初步研究，闡明重要炎癥介質(zhì)HMGB1在EAM發(fā)生、發(fā)展過程中，對浸潤心肌的Mφ極化的調(diào)控機制。
　　方法：
　　1.實驗性自身免疫性心肌炎小鼠模型的構(gòu)建：將豬心肌肌球蛋白制備成抗原肽，多次多點注射于小鼠背部皮下，至21天建模結(jié)束，進行心肌組織切片HE染色和病理評分。
　　2.心肌組織巨噬細胞的浸潤

2、與極化分析：免疫熒光檢測EAM小鼠心肌組織浸潤的F4/80+CD86+巨噬細胞。
　　3. HMGB1對EAM小鼠心肌組織巨噬細胞浸潤和極化的影響：用HMGB1抑制劑丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate，EP）抑制EAM模型中HMGB1的表達與釋放，進行心肌組織切片HE染色和病理評分，免疫熒光檢測EAM小鼠心肌組織浸潤的F4/80+CD86+巨噬細胞。
　　4. HMGB1在體外對巨噬細胞的極化作用：通過實時熒光定量 P

3、CR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）和蛋白印跡（western blot）檢測HMGB1處理后ANA-1巨噬細胞和小鼠原代腹腔巨噬細胞iNOS、Arg-1的mRNA和蛋白水平表達量；酶聯(lián)免疫吸附測定方法（ELISA）檢測細胞培養(yǎng)上清NO分泌量。
　　5. HMGB1體外誘導ANA-1巨噬細胞極化的分子機制：HMGB1處理ANA-1巨噬細胞后，western blot檢測不同時間點PI3K和E

4、RK1/2磷酸化水平，并使用ERK1/2抑制劑U0126抑制ERK1/2磷酸化，再給以HMGB1處理，通過qRT-PCR檢測胞內(nèi)iNOS、Arg-1的mRNA水平表達量。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建實驗性自身免疫性心肌炎小鼠模型。
　　2. EAM小鼠心肌組織F4/80+CD86+M1型巨噬細胞浸潤顯著多于對照組。
　　3. qRT-PCR結(jié)果證明EP可顯著抑制HMGB1表達，且與未處理組相比有統(tǒng)計學差異（P<

5、0.05）。免疫熒光結(jié)果顯示，EAM+EP組浸潤的F4/80+CD86+巨噬細胞顯著少于EAM組。
　　4. qRT-PCR、Western blot和ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HMGB1處理過的ANA-1巨噬細胞和小鼠原代腹腔巨噬細胞中iNOS的表達量增多，NO的產(chǎn)生與分泌增多，而Arg-1的表達減少，即巨噬細胞向促炎的M1型極化。
　　5. HMGB1作用于ANA-1巨噬細胞后， western blot結(jié)果顯示， PI3K和

6、ERK1/2磷酸化水平顯著增高，與對照組相比有統(tǒng)計學意義。且使用U0126抑制ERK1/2磷酸化后再給以HMGB1處理時，與未使用抑制劑組相比，iNOS的mRNA含量明顯降低，而Arg-1 mRNA表達卻增多。
　　結(jié)論：
　　1.實驗性自身免疫性心肌炎小鼠心肌組織中F4/80+CD86+巨噬細胞浸潤增多，抑制HMGB1表達可顯著減少F4/80+CD86+巨噬細胞浸潤。
　　2. HMGB1促進巨噬細胞向M1極化可能是