HMGB1在心肌炎中的致病機制及調(diào)控作用研究.pdf

1、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)為HMG蛋白家族成員之一,廣泛表達于多種組織細胞,具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)固胞核結(jié)構(gòu)以及釋放后具有炎癥介質(zhì)功能的核蛋白,也是一種重要的損傷相關(guān)的分子識別模式(DAMPs)。HMGB1結(jié)構(gòu)高度保守,由215個氨基酸組成,包括A、B-box兩個構(gòu)象高度類似的DNA綁定區(qū)域、受體晚期糖基化終末產(chǎn)物結(jié)合區(qū)(RAGE)和具有負調(diào)控作用的羧基端尾部。機械損傷或壞死的細胞被動釋放HMGB1,而活化的巨噬細胞(Mψ)、樹突狀

2、細胞(DC)則主動分泌HMGB1,釋放或分泌的HMGB1通過與其配體RAGE、TLR2、4、7等結(jié)合既發(fā)揮著對免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用,也參與腫瘤、缺血再灌注損傷、自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展。
　　 自身免疫性心肌炎是Th17細胞介導(dǎo)的一種自身免疫性疾病,繼發(fā)于病毒性心肌炎(VMC)；病毒的感染導(dǎo)致心肌細胞破壞、心肌球蛋白釋放,進而引起自身免疫性心肌炎。自身免疫性心肌炎是擴張型心肌病、心衰的最主要因素。迄今為止,自身免疫性心肌炎的致病

3、機制尚不十分清楚,然而Th17細胞介導(dǎo)的進行性心肌損傷是造成自身免疫性心肌炎的主要因為。實驗性自身免疫性心肌炎(EAM)是研究這一疾病的有效模型,可由柯薩奇病毒或心肌球蛋白α鏈(MyHC-α)誘導(dǎo)產(chǎn)生。研究顯示EAM時血漿HMGB1水平增高、循環(huán)Th17細胞增加,心肌組織中有大量中性粒細胞、Mψ和Th17細胞浸潤。HMGB1和Th17細胞均在EAM時呈現(xiàn)高水平,那么兩者的關(guān)系如何?HMGB1是否通過調(diào)控Th17細胞參與自身免疫性心肌炎的

4、致病?在環(huán)境壓力改變時心肌細胞是否會主動分泌HMGB1,分泌的HMGB1是否參與心肌炎癥的致病?有待于研究證實。
　　 目的:
　　 (1)已有研究發(fā)現(xiàn)釋放或分泌到胞外的HMGB1與抗原提呈細胞(APC)表面的RAGE或TLR4、2、7等模式識別受體(PRR)結(jié)合,通過MyD88依賴或MyD88非依賴途徑,調(diào)節(jié)Th1、Treg等CD4+T細胞的分化、增殖。前期預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)EAM時血清HMGB1水平增加,Th17細胞浸潤增加

5、。HMGB1水平增加與Th17細胞的浸潤有無關(guān)系,其對新發(fā)現(xiàn)的Th17細胞有無調(diào)控作用等,正是本研究所瞄準(zhǔn)的科學(xué)問題。通過項目的實施,力爭闡明HMGB1對Th17細胞的調(diào)節(jié)作用及其在實驗性自身免疫性心肌炎發(fā)生中的作用。
　　 (2)HMGB1是一重要的危險警報分子,長期以來人們一直認為HMGB1主要由活化的巨噬細胞、樹突狀細胞主動分泌或者是由壞死或凋亡的細胞被動釋放。在心臟組織外界環(huán)境壓力改變時作為心臟主要組成成分的心肌細胞是否

6、會主動分泌HMGB1?分泌的HMGB1對心臟的炎癥或心肌功能有何影響?因此,通過本研究的實施闡明心肌細胞能否主動分泌HMGB1,其分泌HMGB1所依賴的分子機制及其在心肌炎癥損傷過程中的作用。
　　 (3)HMGB1作為一重要的炎癥介質(zhì),參與免疫應(yīng)答的調(diào)控及腫瘤、敗血癥、缺血／再灌注損傷、自身免疫性疾病等許多炎癥疾病的致病,中和或抑制HMGB1可以緩解炎癥性疾病的癥狀。因此,本課題制備HMGB1的單克隆抗體并觀察其在心肌炎中的治

7、療作用,為其今后的人源化及其臨床推廣做準(zhǔn)備。
　　 方法:
　　 (1)HMGB1 B-box重組蛋白及其單克隆抗體的制備HMGB1 B-box的質(zhì)粒由第三軍醫(yī)大學(xué)何鳳田教授饋贈,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH5α,然后37℃培養(yǎng)5～7h,待OD值(A600)為1～1.5時加入IPTG,誘導(dǎo)6h后收集細菌。超聲裂解法提取蛋白,層析柱進行純化。純化后的蛋白經(jīng)多粘菌素B柱,抑制細菌內(nèi)毒素活性,-20℃保存待用。用15μg純化

8、的B box蛋白與福氏完全佐劑混合并完全乳化后,經(jīng)皮下多點注射免疫BALB／c小鼠。隔2周同法進行第2次免疫,一周后,經(jīng)尾靜脈加強免疫數(shù)次。細胞融合、亞克隆及mAb腹水的制備均按實驗室常規(guī)方法進行。
　　 (2)小鼠心肌炎模型的誘導(dǎo)及其病理分析MyHC-α614-629與弗氏完全佐劑(CFA)1:1混合,分別在第0和7天,進行小鼠免疫,對照組用CFA和PBS進行免疫。3周后,眼球采血處死小鼠,取出心臟10％的福爾馬林固定。ELI

9、SA檢測血清HMGB1、TNFα、IL-1β、IFN-γ、IL-17；RT-qPCR分析心肌組織HMGB1以及脾臟中IFN-γ、IL-17、T-bet、RORγt的表達。HE染色分析心肌病理損傷程度、免疫熒光觀察Th17細胞在心肌組織中的浸潤情況。
　　 (3)HMGB1對Th17細胞的調(diào)控作用及抗HMGB1 B box單克隆抗體在EAM發(fā)生中的干預(yù)作用陽性選擇法分離CD4+T細胞,在anti-CD3、anti-CD28存在的體

10、系下加入HMGB1,FACS觀察HMGB1對其分化、增殖的影響。并將制備的抗HMGB1 B box單克隆抗體腹腔注射入EAM小鼠病理分析心肌損傷程度、免疫熒光觀察Th17細胞浸潤情況。
　　 (4)LPS對心肌細胞主動分泌HMGB1的影響及其分子機制用160U／ml的膠原酶Ⅱ37℃消化1h,分離新生小鼠心肌細胞反復(fù)吹打后收集細胞,接種到細胞培養(yǎng)板中,靜置貼壁1h,收集未貼壁的細胞轉(zhuǎn)置于另一新的細胞培養(yǎng)板,在含有10％FCS的M1

11、99培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)備用。LPS刺激后觀察其凋亡情況及其HMGB1主動分泌水平。體內(nèi)通過LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素模型觀察心肌細胞HMGB1的主動分泌功能。免疫熒光、western-blot及TLR4-／-、PI3Kγ-／-小鼠闡明心肌細胞主動分泌HMGB1的分子機制。
　　 (5)心肌細胞主動分泌的HMGB1對心肌功能的影響通過WT、PI3Kγ-／-C57BL／6小鼠模型誘導(dǎo)與干預(yù),采用Millar tiptransducer ca

12、theter(SPR-893,1.4 Fr.)儀器評估小鼠心臟功能并通過HE染色分析心肌的損傷及其炎癥損傷程度。
　　 結(jié)果:
　　 (1)HMGB1 B-box質(zhì)粒經(jīng)測序正確后,轉(zhuǎn)化E.coli DH5α后,表達HMGB1 B box蛋白,SDS-PAGE鑒定電泳位置正確；通過雜交瘤技術(shù)制備抗HMGB1 B box的單克隆抗體,篩選到兩株能夠穩(wěn)定分泌抗HMGB1 B box的單克隆抗體細胞株(1D2F4E3和2D4E3

13、A2),兩株細胞株分泌的抗體均為IgGα,κ型,效價達到106以上,與E.coli DH5α基因組蛋白質(zhì)無交叉反應(yīng)。
　　 (2)MyHC-α614-629誘導(dǎo)小鼠EAM,病理分析發(fā)現(xiàn)心肌組織邊緣區(qū)有大量的淋巴細胞浸潤,免疫熒光進一步確認浸潤的細胞為Th17細胞,血清ELISA發(fā)現(xiàn)IL-17水平顯著增高(667.09±120.44 pg／ml vs.68±31.11 pg／ml,p<0.05),HMGB1水平在14天、21天分別

14、為:3717.48±210.93pg／ml、5030.17±1102.08pg／ml,而對照組為2000±1193.39,p<0.05；對小鼠脾臟Th17細胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和細胞因子定量檢測也發(fā)現(xiàn)RORγt和IL-17表達水平增高,而IFN-γ和T-bet沒有明顯變化。
　　 (3)用制備的抗HMGB1 B box的單克隆抗體中和HMGB1。21天后處死小鼠,發(fā)現(xiàn)心肌損傷程度明顯減輕；且免疫熒光和ELISA檢測也發(fā)現(xiàn)Th17細胞

15、的浸潤減輕,血清IL-17明顯降低。體外HMGB1能夠有效地增加Th17細胞的比例；HMGB1中和前后EAM小鼠血清TGF-β、IL-6、IL-1β檢測結(jié)果分別為:1063.58±233.22pg／ml與250.64±152.74 pg／ml；482.81±87.04pg／ml與100.80±73.77pg／ml；8.90±1.84pg／ml與6.47±0.81pg／ml。
　　 (4)小鼠腹腔注射LPS,12～24h后,血漿H

16、MGB1水平明顯增加(200±67.3ng／ml),HMGB1的增加滯后于TNF-α(4h)(575±25.5pg／ml)；免疫熒光分析發(fā)現(xiàn),在對照組小鼠心肌組織中HMGB1的表達主要集中于細胞核,而在LPS刺激后HMGB1在細胞核、漿中均表達增加。體外用不同濃度的LPS刺激新生鼠心肌細胞,發(fā)現(xiàn)用10μg／ml LPS刺激心肌細胞并不影響心肌細胞活性,但會導(dǎo)致心肌細胞主動分泌HMGB1。LPS刺激心肌細胞后在5～15min時PI3Kγ磷

17、酸化程度增強,相同的現(xiàn)象在TLR4-／-的小鼠分離的心肌細胞中并沒有被觀察到。而且也發(fā)現(xiàn)PI3Kγ抑制劑(AS605240),能夠有效地抑制心肌細胞主動分泌HMGB1；同樣現(xiàn)象也在PI3Kγ-／-的心肌細胞中被觀察到。
　　 (5)免疫組化分析發(fā)現(xiàn),在WT小鼠內(nèi)毒素模型的心肌組織HMGB1表達水平增加,而心肌組織并沒有炎癥和病理改變,小鼠注射LPS24h后心肌收縮功能發(fā)生障礙,且這種障礙能夠通過注射HMGB1拮抗劑A-box或者

18、是抑制劑GZA緩解。小鼠腹腔注射HMGB1蛋白,1h后檢測循環(huán)中HMGB1的水平并評估心肌功能,發(fā)現(xiàn)直接注射HMGB1并沒有影響心肌功能,直到血清HMGB1增加后心臟收縮發(fā)生障礙。
　　 結(jié)論:
　　 (1)成功地篩選到了兩株分泌抗HMGB1 B box的單克隆抗體細胞株,兩株細胞株分泌的抗體均為IgG2a,κ型,效價達到106以上,有良好的特異性。
　　 (2)利用MyHCα614-629成功的誘導(dǎo)了小鼠EAM

19、,而且證實在MyHCα614-629誘導(dǎo)的心肌炎中以Th17細胞浸潤為主,并伴隨有HMGB1分泌水平的增高；利用自制的抗HMGB1 B box的單克隆抗體中和循環(huán)中的HMGB1能夠有效減輕心肌病理損傷,降低Th17細胞浸潤。這提示心肌炎時由于心肌細胞損傷、免疫細胞浸潤而釋放的HMGB1可能對Th17細胞具有調(diào)控作用；HMGB1有望成為自身免疫性心肌炎潛在治療靶位。
　　 (3)在MyHCα614-629誘導(dǎo)的EAM模型中中和HM

20、GB1能夠減少Th17細胞浸潤,這提示HMGB1的分泌與Th17細胞的浸潤存在著相關(guān)性。因此,體外研究了HMGB1對Th17細胞的調(diào)控作用,發(fā)現(xiàn)HMGB1可能通過調(diào)節(jié)Th17細胞的增殖、分化、極化,導(dǎo)致了EAM小鼠心肌組織Th17細胞浸潤增多,這也是首次提出HMGB1對CD4+Th17細胞具有調(diào)控作用。
　　 (4)用LPS刺激分離的新生鼠心肌細胞發(fā)現(xiàn)心肌細胞會主動分泌HMGB1,這一結(jié)論在體內(nèi)敗血癥／內(nèi)毒素血癥模型中也得以證實

21、,這是繼垂體細胞、肝細胞和上皮細胞后第四個能主動分泌HMGB1的非免疫細胞。在此基礎(chǔ)之上,進一步探索了心肌細胞主動分泌HMGB1所依賴的分子機制,發(fā)現(xiàn)心肌細胞主動分泌HMGB1的機制與免疫細胞主動分泌HMGB1機制一樣均是PI3Kγ依賴的。
　　 (5)用LPS在C57BL／6小鼠誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥模型24小時后分析發(fā)現(xiàn),在短期內(nèi)由于外界環(huán)境壓力刺激心肌細胞主動釋放的HMGB1沒有導(dǎo)致心肌的炎癥,但是會導(dǎo)致心肌收縮功能障礙。這一結(jié)論