HMGB1在RNA聚合酶Ⅲ識別poly(da-dT)中的作用及機(jī)制.pdf

1、研究發(fā)現(xiàn),外源及自身DNA可通過胞內(nèi)DNA感受器啟動固有免疫應(yīng)答,近年來對新型DNA感受器的鑒定及其功能調(diào)控迅速成為免疫學(xué)領(lǐng)域的新興方向和重要學(xué)術(shù)關(guān)注。
　　 在本研究中,為了探討HMGB1在新型DNA感受器PolⅢ識別外源DNA中的作用機(jī)制,我們首先通過Real-time PCR檢測poly(dA-dT)刺激后細(xì)胞內(nèi)HMGB1在mRNA水平上的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,HMGB1在293T細(xì)胞內(nèi)上調(diào)達(dá)40倍,在Raw264.7細(xì)胞中

2、上調(diào)約7倍。接下來,我們分析了HMGB1在PolⅢ識別poly(dA-dT)產(chǎn)生IFN-β中的作用。當(dāng)使用ML60218抑制劑特異性阻斷PolⅢ的活性后,IFN-β的表達(dá)水平顯著下降,且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性;當(dāng)ML60218使用濃度為10μM時(shí),IFN-β的表達(dá)相比未抑制組下調(diào)5倍左右,表明DNA感受器中PolⅢ對IFN-β的產(chǎn)生發(fā)揮關(guān)鍵性作用。隨后,我們通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)HMGB1的表達(dá)量來探討其在PolⅢ-RIG-Ⅰ通路中作用。在HMG

3、B1上調(diào)表達(dá)過程中,因HMGB1的本底表達(dá)水平較高,我們未觀察到HMGB1對IFN-β產(chǎn)生的影響;在HMGB1下調(diào)表達(dá)過程中,我們以攜帶特異性shRNA的慢病毒載體穩(wěn)定下調(diào)HMGB1表達(dá)后發(fā)現(xiàn),poly(dA-dT)刺激細(xì)胞產(chǎn)生IFN-β的能力大幅下降,約8倍左右,表明HMGB1參與了PolⅢ對外源DNA的識別過程。
　　 為了進(jìn)一步研究HMGB1和PolⅢ在細(xì)胞內(nèi)可能存在的相互作用,我們運(yùn)用了免疫共沉淀技術(shù)和熒光共定位分析。免

4、疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中,我們以HMGB1為誘餌蛋白,檢測免疫沉淀復(fù)合物中帶有Flag標(biāo)簽PolⅢ亞基POLR-3D的表達(dá)。結(jié)果顯示,HMGBl與PolⅢ不存在直接相互作用。但在熒光共定位實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)帶有不同熒光蛋白標(biāo)簽的PolⅢ亞基POLR-3D和HMGB1,在293T和Raw264.7細(xì)胞內(nèi)存在共定位,這一現(xiàn)象提示HMGB1可能通過間接結(jié)合方式調(diào)控了PolⅢ對外源DNA的識別及下游Ⅰ型干擾素的分泌過程。
　　 本研究著重探討胞質(zhì)D