RNA聚合酶I抑制劑阻止動(dòng)脈新生內(nèi)膜形成的藥理作用及機(jī)制研究.pdf

1、RNA聚合酶Ⅰ抑制劑阻止動(dòng)脈新生內(nèi)膜形成的藥理作用及機(jī)制研究
　　研究背景：
　　冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)后發(fā)生再狹窄是冠脈介入治療失敗的重要原因。動(dòng)脈支架植入技術(shù)投入臨床使用后，再狹窄發(fā)病率明顯降低，顯著減少了介入術(shù)后血管彈性收縮和血管重塑，但無法完全抑制新生內(nèi)膜增生。在正常血管的中膜中，平滑肌細(xì)胞以極低速率增殖且大部分都處于細(xì)胞周期的G0期，為“靜止”狀態(tài)。而血管損傷會(huì)刺激平滑肌細(xì)胞活化，進(jìn)入細(xì)胞周期的增殖階段，并增加細(xì)胞遷移

2、。為了抑制這種現(xiàn)象，以抑制平滑肌增殖為主要靶點(diǎn)的幾種藥物如雷帕霉素等，現(xiàn)在臨床廣泛用于制作藥物洗脫支架，雖然藥物支架不能完全避免新生內(nèi)膜增生，但已被證明可以降低再狹窄的發(fā)生率。然而近來有研究表明，使用藥物洗脫支架進(jìn)行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療的患者和使用裸金屬支架的患者相比，出現(xiàn)了“晚期追趕”現(xiàn)象，即六年死亡率、生活質(zhì)量、不穩(wěn)定性心絞痛入院等方面無顯著差異。為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，需要尋求新的靶點(diǎn)以及更好的治療方法來防治再狹窄的發(fā)生。
　　損

3、傷血管新生內(nèi)膜增生時(shí)，平滑肌細(xì)胞大量增殖。而細(xì)胞增殖需要合成大量蛋白質(zhì)。核糖體是蛋白質(zhì)合成的工廠。在細(xì)胞核仁中，RNA聚合酶Ⅰ轉(zhuǎn)錄核糖體DNA成為核糖體RNA前體，經(jīng)過多個(gè)步驟的剪切，生成成熟的18S,5.8S和28S核糖體RNA，進(jìn)而與核糖體蛋白結(jié)合形成核糖體大小亞基。在某些腫瘤細(xì)胞中，RNA聚合酶Ⅰ過度活化，而抑制核糖體RNA合成能夠降低細(xì)胞的增殖能力。CX-5461是一種新型的RNA聚合酶Ⅰ的特異性抑制劑，研究證實(shí)CX-5461對(duì)

4、于快速增殖狀態(tài)下的細(xì)胞有明顯的抑制作用，該化合物目前正在進(jìn)行白血病和實(shí)體腫瘤治療的早期臨床實(shí)驗(yàn)。干預(yù)RNA聚合酶Ⅰ對(duì)心血管細(xì)胞的作用目前尚沒有任何報(bào)道。有證據(jù)表明，血管平滑肌細(xì)胞的增殖可能和蛋白質(zhì)合成速率增加有關(guān)。因此，在以下的研究中，我們檢測(cè)了特異性RNA聚合酶Ⅰ抑制劑CX-5461在血管平滑肌細(xì)胞中的藥理作用，探討了CX-5461在抑制平滑肌異常增殖及動(dòng)脈再狹窄過程中的可能機(jī)制。
　　研究目的：
　　1.研究CX-546

5、1對(duì)于大鼠頸動(dòng)脈球囊拉傷模型后內(nèi)膜增生的影響。
　　2.研究CX-5461改善血管損傷后新生內(nèi)膜增生的生物學(xué)機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自北京維通利華公司，選取250-300g雄性Wistar大鼠。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的規(guī)定和要求。大鼠被隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組(Sham)、球囊拉傷組、球囊拉傷+CX-5461低劑量(0.7μ M)組、球囊拉傷+C

6、X-5461高劑量(14μ M)組。
　　2.建立動(dòng)物模型
　　大鼠根據(jù)體重進(jìn)行麻醉，腹腔注射0.8％戊巴比妥鈉(60mg/kg)。備皮后取頸部正中切口，暴露頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)外動(dòng)脈。阻斷頸總動(dòng)脈血流，在頸外動(dòng)脈近心端用縫合線打一活結(jié)，隨后在頸外動(dòng)脈活結(jié)遠(yuǎn)心端做一切口，使用1.25*10mm球囊從切口處進(jìn)入頸總動(dòng)脈約2cm，給予3atm壓力使球囊擴(kuò)張，向遠(yuǎn)心端回撤球囊至切口處，釋放球囊壓力，再次送入頸總動(dòng)脈，三次操作后撤出球囊，

7、結(jié)扎頸外動(dòng)脈切口近心端。逐層縫合組織。將CX-5461以不同濃度（溶于5％DMSO溶液）溶于25％的Pluronic F127溶液中，在拉傷部位滴加200μ L。球囊拉傷組滴加含有5％DMSO的Pluronic F127溶液。假手術(shù)組只暴露血管，滴加5％DMSO-Pluronic F127溶液，不進(jìn)行球囊拉傷。逐層縫合組織。術(shù)后給予美洛昔康(1 mg/kg)鎮(zhèn)痛處理。
　　3.組織取材、制作切片
　　實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)后14天進(jìn)行取

8、材。麻醉后暴露頸總動(dòng)脈，取拉傷部位大鼠頸總動(dòng)脈組織4％多聚甲醛固定過夜，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，制作4μm血管橫切片;剩余大鼠血管組織液氮保存。
　　4.組織病理學(xué)檢測(cè)
　　組織切片脫蠟、復(fù)水，進(jìn)行Verhoeff-Van Gieson染色（彈力板呈棕色，使新生內(nèi)膜更加明顯），蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin)染色。中性樹脂封片、干燥，顯微鏡下觀察并保存圖像。
　　5.伊文氏藍(lán)檢測(cè)
　　大鼠安樂死前3

9、0分鐘，經(jīng)尾靜脈注射0.5毫升0.5％伊萬斯藍(lán)染料。按照上述步驟取出球囊損傷的頸動(dòng)脈段，將血管固定在100％甲醇并縱向切開。鏡下觀察并采集圖像。
　　6.組織化學(xué)檢測(cè)
　　組織切片經(jīng)過脫蠟、復(fù)水、3％H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶、抗原修復(fù)、封閉，4攝氏度孵育不同目的蛋白的一抗過夜，次日37攝氏度孵育二抗2小時(shí)，滴加DAB顯色液，同一目的蛋白使用同一時(shí)間顯色。用蘇木素將細(xì)胞核染色，中性樹脂封片、干燥。顯微鏡下觀察并采集圖像。<

10、br>　　7.組織免疫熒光檢測(cè)
　　組織切片經(jīng)過脫蠟、復(fù)水、3％H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶、抗原修復(fù)、5％BSA封閉，4攝氏度孵育不同目的蛋白的一抗過夜，次日37攝氏度孵育免疫熒光二抗，DAPI染核，抗熒光淬滅劑封片。
　　8.組織蛋白質(zhì)免疫印跡
　　用研磨器裂解頸總動(dòng)脈組織并在冰上提取蛋白，SDS-PAGE電泳恒壓分離蛋白樣品，將蛋白濕式轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上，用5％脫脂奶粉封閉，4℃搖床孵不同目的蛋白特異性一抗過夜

11、，次日TBST洗膜3次，室溫孵育二抗2小時(shí)。ECL發(fā)光液使目的蛋白條帶顯影，并用LAS-4000化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)。
　　9.組織實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)
　　實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)后14天取材，液氮保存。將凍存的組織加入Trizol，用研磨器研磨，隨后依次分別加入氯仿、異丙醇、無水乙醇逐次離心使RNA析出，提取RNA并測(cè)量濃度。根據(jù)Takara PrimeScriptTM RT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄。隨后根據(jù)SYB

12、R(⑧)Select Master Mix試劑盒提供的方法進(jìn)行Real-time PCR，以GAPDH或β-actin作為管家基因，檢測(cè)目的基因表達(dá)量，用相對(duì)定量的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　10.血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)
　　小鼠血管平滑肌細(xì)胞系MOVAS購(gòu)自ATCC公司。細(xì)胞用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中以37攝氏度，5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)密度達(dá)80％左右時(shí)將細(xì)胞傳代。
　　11.細(xì)胞活力測(cè)定<

13、br>　　采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性。將細(xì)胞接種于96孔板中，給予不同刺激后根據(jù)CellTiter96 Aqueous kit(Promega)試劑盒，選取490nm波長(zhǎng)用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。
　　12.數(shù)據(jù)測(cè)量及統(tǒng)計(jì)
　　數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)分析使用非配對(duì)t檢驗(yàn)或方差分析以及Newman-Keuls兩兩檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。認(rèn)為P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.CX-5461的藥理學(xué)特征

14、　　由于之前沒有CX-5461對(duì)于心血管系統(tǒng)作用的相關(guān)研究，我們先檢測(cè)CX-5461對(duì)于MOVAS的藥理學(xué)特征。使用MTT法檢測(cè)CX-5461對(duì)細(xì)胞的增殖的抑制作用，得出其EC50=1.06μ M。
　　2.CX-5461對(duì)血管損傷誘導(dǎo)的新生內(nèi)膜增生的影響
　　根據(jù)CX-5461對(duì)細(xì)胞的抑制作用的檢測(cè)，我們選取高于和低于EC50的濃度（14μM和0.7μ M）來檢測(cè)藥物對(duì)球囊拉傷后血管新生內(nèi)膜形成的抑制作用。通過不同組大鼠組

15、織的HE染色和Verhoeff染色對(duì)比:術(shù)后14天，0.7μM和14μ MCX-5461組大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)膜面積、內(nèi)膜/中膜面積比(I/M)均低于球囊拉傷組，且呈劑量依賴關(guān)系。而CX-5461對(duì)于正常血管中膜細(xì)胞的大體形態(tài)、分布，沒有明顯影響。
　　3.CX-5461對(duì)血管壁細(xì)胞增殖周期的影響
　　我們對(duì)血管組織進(jìn)行PCNA、cyclin A和Aurora B免疫組化或免疫熒光染色。Aurora B是有絲分裂期的標(biāo)志。假手術(shù)組

16、、拉傷組血管中膜均未發(fā)現(xiàn)AuroraB陽(yáng)性細(xì)胞。研究證實(shí)，位于核仁中的cyclinA發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用，而cyclin A在S-G2期表達(dá)量較高。因此我們統(tǒng)計(jì)了在核仁中高表達(dá)cyclin A的細(xì)胞比例，結(jié)果顯示:球囊拉傷組血管中膜高表達(dá)cyclin-A的細(xì)胞數(shù)量有所下降，原因可能是活化的平滑肌細(xì)胞遷移至內(nèi)膜;而CX-5461組血管中膜中高表達(dá)cyclin-A的細(xì)胞較假手術(shù)組明顯升高。PCNA經(jīng)常作為細(xì)胞增殖旺盛的標(biāo)志，其在細(xì)胞周期中

17、G1開始合成，S期表達(dá)水平最高。假手術(shù)組、拉傷組和給藥組中膜中PCNA-高表達(dá)的細(xì)胞并無顯著性差異。綜合分析以上結(jié)果，提示CX-5461能夠引起血管中膜平滑肌細(xì)胞G2/M期細(xì)胞周期阻滯。
　　4.CX-5461對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響
　　血管伊文氏藍(lán)染色結(jié)果顯示:低劑量的CX-5461對(duì)血管內(nèi)皮的恢復(fù)過程無明顯影響，而高劑量CX-5461使血管再內(nèi)皮化率降低約35％。
　　5.球囊損傷后血管組織核糖體RNA合成增加

18、>　　上游結(jié)合因子-1（phosphorylation of upstream binding factor-1，UBF-1）是rDNA轉(zhuǎn)錄所必須的核轉(zhuǎn)錄因子。我們用免疫組化方法對(duì)血管組織中的UBF-1磷酸化水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示損傷組血管新生內(nèi)膜部分和中膜部分UBF-1磷酸化水平均明顯升高，提示血管損傷后新生內(nèi)膜形成過程中rRNA合成增強(qiáng)。
　　6.CX-5461增加p53磷酸化、乙?；?br>　　研究顯示p53的翻譯后修

19、飾，包括磷酸化和乙酰化，可以增強(qiáng)p53的轉(zhuǎn)錄因子功能。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:血管中膜中p53的磷酸化水平和p53的乙?；捷^假手術(shù)組和損傷組均有所升高，同時(shí)，新生內(nèi)膜中這些指標(biāo)也升高明顯。與此相一致，qPCR結(jié)果顯示CX-5461處理后p53的靶基因p21CIP/WAF1和GADD45的表達(dá)水平顯著增加。組織westernblot結(jié)果顯示:和假手術(shù)組相比，CX-5461高劑量組（無新生內(nèi)膜）血管組織的p53磷酸化和乙?；蕉加兴?/p>

20、升高，而球囊損傷組血管組織的p53磷酸化和乙?；揭采呙黠@，其原因可能是組織包含的新生內(nèi)膜中p53翻譯后修飾水平較高。
　　7.CX-5461引起ATM/ATR通路的激活
　　研究顯示，p53的磷酸化和G2/M過渡期都受ATM（共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變基因the ataxia telangiectasia mutated）/ATR（共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥與Rad3相關(guān)ataxia telangiectasia and

21、Rad3-related）通路的調(diào)節(jié)。我們通過檢測(cè)ATM/ATR底物結(jié)構(gòu)域S/T*Q的磷酸化水平對(duì)ATM/ATR通路的活性進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)CX-5461處理后ATM/ATR通路的活性顯著增加。
　　結(jié)論：
　　1.CX-5461顯著抑制動(dòng)脈損傷造成的新生內(nèi)膜增生。
　　2.CX-5461可能引起損傷血管中膜細(xì)胞發(fā)生GjM周期阻滯。
　　3.CX-5461抑制細(xì)胞增殖可能通過激活A(yù)TM/ATR通路發(fā)揮作用。
　

22、　關(guān)鍵詞:CX-5461;再狹窄:平滑肌細(xì)胞;細(xì)胞周期;ATM/ATR
　　RNA聚合酶Ⅰ抑制劑阻止血管平滑肌細(xì)胞快速增殖的藥理作用及機(jī)制研究
　　研究背景：
　　我們之前的研究表明，RNA聚合酶Ⅰ抑制劑CX-5461在大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型中，可以抑制受損血管新生內(nèi)膜形成，并且ATM/ATR通路的激活和p53翻譯后修飾水平升高可能參與介導(dǎo)抑制作用。但其細(xì)胞水平的作用和機(jī)制尚未闡明。CX-5461是一種新型RNA聚合酶

23、Ⅰ特異性抑制劑，能夠抑制某些腫瘤細(xì)胞中RNA聚合酶Ⅰ的過度活化，抑制其快速增殖。在本研究中，我們探究CX-5461對(duì)快速增殖的血管平滑肌細(xì)胞的藥理作用及主要機(jī)制。
　　近年來，以細(xì)胞周期及其調(diào)控因子作為再狹窄治療的作用靶點(diǎn)的研究越來越多。細(xì)胞周期包括兩個(gè)時(shí)期:間期（兩個(gè)有絲分裂期之間的時(shí)期）;分裂期（細(xì)胞分裂的過程）。間期分為四個(gè)時(shí)期:G0，G1，S和G2。G1期中，細(xì)胞為DNA復(fù)制做準(zhǔn)備，在G1后期存在檢查點(diǎn)R。之后，細(xì)胞在S期

24、進(jìn)行DNA復(fù)制，在G2期合成有絲分裂所需要的大量蛋白質(zhì)。同時(shí)，G2期也有一個(gè)檢查點(diǎn)來檢測(cè)合成DNA的質(zhì)量。細(xì)胞周期調(diào)控對(duì)于血管平滑肌細(xì)胞增殖至關(guān)重要，因此我們?cè)诖瞬糠痔剿鰿X-5461是否對(duì)細(xì)胞周期產(chǎn)生影響。
　　核仁是核糖體生物合成的場(chǎng)所，破壞核仁的正常功能會(huì)產(chǎn)生一種獨(dú)特的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，稱為核仁應(yīng)激，造成p53蛋白水平升高。CX-5461是核糖體DNA轉(zhuǎn)錄所必須的RNA聚合酶Ⅰ的特異性抑制劑。在此部分研究中，我們將探索PolⅠ抑

25、制在血管平滑肌細(xì)胞中是否引起核仁應(yīng)激反應(yīng)。
　　ATM(共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因ataxia telangiectasia-mutated)/ATR(共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥和Rad-3相關(guān)蛋白，ataxia telangiectasia-mutatedand Rad-3 related factor)激酶系統(tǒng)是DNA損傷時(shí)激活的經(jīng)典通路。ATM、ATR都屬于PI-3K家族，功能既有重復(fù)也不完全相同。UV、缺氧等條件都能激活A(yù)

26、TM/ATR通路并活化下游靶蛋白（如p53蛋白等），阻滯細(xì)胞周期，從而對(duì)受損DNA進(jìn)行修復(fù)。我們?cè)诖颂接慍X-5461對(duì)血管平滑肌細(xì)胞中ATM/ATR通路的作用。
　　研究證實(shí)，現(xiàn)在臨床廣泛應(yīng)用的雷帕霉素藥物洗脫支架會(huì)延緩術(shù)后再內(nèi)皮化的過程，可能導(dǎo)致術(shù)后血栓形成，是影響介入手術(shù)結(jié)果的重要因素。在本研究中，我們也初步探討CX-5461對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。
　　研究目的:
　　1.研究CX-5461在細(xì)胞水平對(duì)血管平滑

27、肌細(xì)胞增殖的影響。
　　2.探索CX-5461抑制血管平滑肌細(xì)胞快速增殖的可能機(jī)制。
　　3.初步研究CX-5461對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。
　　研究方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　1.1.小鼠血管平滑肌細(xì)胞系MOVAS的培養(yǎng)
　　細(xì)胞來源、培養(yǎng)方法同論文Ⅱ。
　　1.2.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)
　　人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(Human Umbilical Vein Endothelial Cell

28、，HUVEC)購(gòu)自ATCC公司。細(xì)胞培養(yǎng)于含有5％胎牛血清、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(100U/ml)以及青鏈霉素(100μ g/ml)的完全內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)。細(xì)胞培養(yǎng)箱溫度穩(wěn)定37℃，CO2濃度為5％。細(xì)胞密度達(dá)到70-80％時(shí)傳代，選擇第3-6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　1.3.原代大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞提取及培養(yǎng)
　　取150-250gWistar雄性大鼠一只，腹腔注射0.8％戊巴比妥鈉(60mg/kg)進(jìn)行麻醉，在無菌條件

29、下迅速暴露胸主動(dòng)脈并將其取出，置入D-Hanks液無菌培養(yǎng)皿中。清洗血管中的血塊并剝?nèi)ネ饽?，縱向剪開血管，用鑷子刮去內(nèi)膜。將血管盡量剪碎并離心，接種于含有20％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，3-5天換液。細(xì)胞密度大時(shí)可呈峰-谷樣表現(xiàn)。
　　2.TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　將MOVAS接種于八孔腔室載玻片，次日給予梯度濃度的CX-5461處理，以猩孢霉素(100nM)處理組為陽(yáng)性對(duì)

30、照組。根據(jù)ApopTag Plus Peroxidase In SituApoptosis Detection Kit(Merck Millipore)試劑盒檢測(cè)MOVAS凋亡情況。中性樹脂封片、干燥，顯微鏡下，每孔隨機(jī)選取5-10個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)觀察并保存影像。
　　3.細(xì)胞Caspase3/7活性檢測(cè)
　　將MOVAS接種于96孔板中，次日給予梯度濃度的CX-5461處理，并設(shè)立猩孢霉素組為陽(yáng)性對(duì)照組，5％D

31、MSO組為陰性對(duì)照組。用預(yù)先配好的Caspase-Glo3/7工作液孵育細(xì)胞1小時(shí)，隨后將樣品移入不透光的96孔板中，用熒光酶標(biāo)儀檢進(jìn)行檢測(cè)。
　　4.細(xì)胞活力測(cè)定
　　同論文Ⅱ。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期
　　將細(xì)胞接種于6孔板，藥物處理后，將細(xì)胞用胰酶消化、離心，PBS洗滌后，以75％乙醇重懸細(xì)胞，置于-20℃冰箱固定過夜。次日用PBS洗滌細(xì)胞2次，離心沉淀后使用碘化丙啶染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

32、
　　6.細(xì)胞蛋白免疫印跡
　　在冰上用RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取蛋白，SDS-PAGE電泳恒壓分離蛋白樣品，將蛋白用濕式轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。5％脫脂奶粉封閉并孵育不同目的蛋白的特異性一抗，在4攝氏度搖床上過夜，次日用TBST洗膜3次，室溫孵育二抗2小時(shí)后檢測(cè)蛋白條帶顯影。
　　7.細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)目的蛋白
　　將細(xì)胞接種于八孔腔室載玻片，藥物處理結(jié)束后以4％多聚甲醛固定，5％BSA封閉，隨后加入特異性一

33、抗4℃孵育過夜，次日孵育免疫熒光二抗，用DAPI染液染細(xì)胞核，抗熒光淬滅劑封片。
　　8.GADD45 shRNA病毒侵染
　　將MOVAS接種于96孔板中，次日用含有5μ g/ml Polybrene的DMEM培養(yǎng)基稀釋病毒，并替換原培養(yǎng)基。24小時(shí)后換液。48小時(shí)后于熒光顯微鏡下觀察熒光，檢測(cè)病毒侵染效率。
　　9.Transwell遷移試驗(yàn)
　　采用Boyden小室法進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)。消化、離心后，重懸HUVE

34、C于無血清的ECM培養(yǎng)基中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果調(diào)整細(xì)胞數(shù)，使每孔細(xì)胞數(shù)目達(dá)到一致。于上室中加入細(xì)胞懸液，下室培養(yǎng)基中加入1％胎牛血清作為趨化因子，上下室培養(yǎng)基同時(shí)含有CX-5461或5％DMSO。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)后固定小室底部的細(xì)胞并用結(jié)晶紫染色。顯微鏡下觀察，每個(gè)小室取5-10個(gè)視野計(jì)數(shù)并采集圖像。
　　10.劃痕試驗(yàn)
　　將細(xì)胞接種于6孔板，待密度達(dá)100％時(shí)用槍頭沿直尺垂直于6孔板底部在細(xì)胞上迅速劃過。

35、細(xì)胞分別給予CX-5461或5％DMSO處理，于1、3、6、9、12、24小時(shí)采集圖像，觀察細(xì)胞遷移情況。提前做好標(biāo)記，記錄同一位置細(xì)胞遷移情況。
　　11.數(shù)據(jù)測(cè)量及統(tǒng)計(jì)
　　數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)分析使用非配對(duì)t檢驗(yàn)或方差分析以及Newman-Keuls兩兩檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。認(rèn)為P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.CX-5461對(duì)MOVAS增殖的影響
　　根據(jù)CX-5461的EC5

36、0，用不同濃度的CX-5461處理細(xì)胞，通過MTT法檢測(cè)藥物對(duì)MOVAS增殖情況的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:0.07μ M，0.7μ M，2μ M，14μM的CX-5461均能抑制MOVAS增殖，且抑制作用呈劑量依賴趨勢(shì)。
　　2.CX-5461對(duì)MOVAS凋亡的影響
　　通過Caspase3/7活性檢測(cè)法和TUNEL法檢測(cè)CX-5461處理MOVAS的凋亡情況。結(jié)果顯示:CX-54610.07μ M、0.7μ M、2μM、14μ

37、M處理組和對(duì)照組相比，MOVAS凋亡情況無明顯差異。因此，我們推測(cè)，CX-5461對(duì)MOVAS增殖的抑制作用并不依賴于細(xì)胞凋亡。
　　3.CX-5461對(duì)血管平滑肌細(xì)胞Aurora B表達(dá)的影響
　　通過免疫熒光檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)，CX-5461處理降低血管平滑肌細(xì)胞中AuroraB的水平。提示CX-5461處理能夠減少處于分裂期的血管平滑肌細(xì)胞的比例。
　　4.CX-5461對(duì)血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響
　　通過流

38、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示:用CX-5461處理MOVAS，處于G2/M期細(xì)胞的比例較對(duì)照組明顯增加，提示CX-5461處理MOVAS導(dǎo)致細(xì)胞G2/M期阻滯。鑒于MOVAS是經(jīng)過改造的血管平滑肌細(xì)胞系，為了更好的模擬體內(nèi)情況，我們選擇大鼠胸主動(dòng)脈原代平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth musclecell，VSMC)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并設(shè)置PDGF-BB處理(20ng/ml)組，使VSMC快速增殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在未經(jīng)PDGF-BB

39、處理的VSMC中，與對(duì)照組相比，CX-5461對(duì)細(xì)胞周期的作用不明顯;而在PDGF-BB處理的VSMC中，CX-5461組細(xì)胞與對(duì)照組相比，處于G2/M期的細(xì)胞比例明顯升高。細(xì)胞免疫熒光染色顯示:用CX-5461處理VSMC，高表達(dá)PCNA細(xì)胞的比例和對(duì)照組相比無明顯差異;而CX-5461處理組中，cyclin A定位于核仁中的細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組。綜合分析以上結(jié)果，提示CX-5461處理導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞G2/M周期阻滯。
　

40、　5.CX-5461增加p53磷酸化水平但不能穩(wěn)定p53
　　我們通過測(cè)定核仁定位標(biāo)記物NPM/B23(Nucleophosmin)的狀態(tài)來檢測(cè)CX-5461抑制PolⅠ是否會(huì)引起核仁應(yīng)激。NPM免疫熒光顯示:0.7μMCX-5641處理并不引起MOVAS中NPM分布的明顯改變，而14μM處理組細(xì)胞NPM碎裂并彌散分布于核質(zhì)，細(xì)胞發(fā)生明顯的核仁應(yīng)激。通過westernblot和免疫熒光檢測(cè)MOVAS和VSMC的p53水平，均未發(fā)現(xiàn)

41、p53水平升高，因此我們推測(cè)CX-5461的作用并不能完全用傳統(tǒng)的核仁應(yīng)激理論來解釋。此外，我們發(fā)現(xiàn)，CX-5461能引起p53磷酸化水平增加。為了研究p53在CX-5461對(duì)細(xì)胞的影響中是否起作用，我們用特異性p53抑制劑PFT-a(pifithrin-a)預(yù)處理血管平滑肌細(xì)胞，再給予CX-5461處理，檢測(cè)CX-5461對(duì)細(xì)胞周期的影響，流式檢測(cè)結(jié)果顯示:PFT-a可以減弱CX-5461對(duì)細(xì)胞G2/M期的阻滯作用。此外，血管組織的P

42、CR結(jié)果顯示CX-5461可以明顯增加p53靶基因p21CIP/WAF1和GADD45的表達(dá)。既往研究表明，p21CIP/WAF1主要調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中G1/S期的過渡，而GADD45主要調(diào)節(jié)G2/M期，因此我們合成表達(dá)GADD45 shRNA的腺病毒并將其轉(zhuǎn)入MOVAS中。MTT結(jié)果顯示:GADD45的shRNA處理可以增加MOVAS增殖的基礎(chǔ)水平，而與CX-5461聯(lián)合應(yīng)用可以抵消其部分抑制增殖的作用。
　　6.PolⅠ抑制激活血

43、管平滑肌細(xì)胞ATM/ATR通路
　　為了研究細(xì)胞水平ATM/ATR通路的活化是否參與PolⅠ抑制，我們用westernblot和免疫熒光對(duì)MOVAS和VSMC中ATM/ATR底物結(jié)構(gòu)域S/T*Q的磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示: CX-5461可以引起細(xì)胞ATM/ATR通路的激活。接下來我們分別用ATM特異性抑制劑KU-55933和ATR特異性抑制劑VE-821處理血管平滑肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ATR的抑制劑VE-821可以部分抵消CX-54

44、61阻滯細(xì)胞周期以及升高p53磷酸化水平的作用，而ATM抑制劑KU-55933并不能改變CX-5461對(duì)細(xì)胞的作用。
　　7.PolⅠ抑制導(dǎo)致p53乙?；黾?br>　　血管組織的免疫組化染色顯示CX-5461處理能使p53乙酰化水平增強(qiáng)。我們也檢測(cè)了細(xì)胞水平CX-5461處理對(duì)p53乙?；降挠绊?，結(jié)果顯示:CX-5461明顯增強(qiáng)了MOVAS和VSMC中p53乙?；健?br>　　8.CX-5461對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷

45、移的影響
　　MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:0.7和14μM的CX-5461均能抑制HUVEC增殖，且其作用依賴于給藥劑量。劃痕實(shí)驗(yàn)中，CX-5461處理組和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無明顯差異。但在Trans-well實(shí)驗(yàn)中，14μ MCX-5461處理抑制HUVEC遷移。
　　結(jié)論：
　　1.CX-5461抑制MOVAS增殖，且不引起細(xì)胞凋亡增加。
　　2.CX-5461對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用不能完全用經(jīng)典的核仁應(yīng)激

46、理論解釋，不引起p53穩(wěn)定但增強(qiáng)其磷酸化、乙?；?。
　　3.CX-5461可引起快速增殖的血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生G2/M周期阻滯。
　　4.CX-5461抑制細(xì)胞增殖可能通過激活A(yù)TR，而非ATM發(fā)揮作用。
　　5.CX-5461抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，但低劑量給藥對(duì)其遷移影響不明顯。
　　關(guān)鍵詞:CX-5461;VSMC;細(xì)胞周期;p53; ATM/ATR
　　CX-5461激活平滑肌細(xì)胞Nrf2通路拮

47、抗其促凋亡作用
　　研究背景：
　　在上一部分論文中，我們發(fā)現(xiàn)PolⅠ抑制劑通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯來抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，與其在腫瘤細(xì)胞中的作用不同，PolⅠ抑制并未細(xì)胞凋亡。ATR-p53通路參與介導(dǎo)了PolⅠ抑制劑抑制細(xì)胞增殖的過程，ATR激酶的激活依賴于許多因素，包括DNA斷裂或多種不伴隨DNA斷裂的刺激，包括缺氧、機(jī)械刺激、氧化應(yīng)激等。研究證實(shí)，ROS水平升高導(dǎo)致的氧化應(yīng)激在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用（促進(jìn)細(xì)

48、胞增殖、遷移，增強(qiáng)抗凋亡活性，同時(shí)也能引起DNA損傷）。在心血管系統(tǒng)中，血管介入術(shù)導(dǎo)致的機(jī)械損傷和炎癥刺激使血管壁發(fā)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，氧化應(yīng)激也在其中扮演了重要角色。
　　血管再狹窄的過程中，血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生異常增殖和遷移，而氧化應(yīng)激可以加速這一過程。氧化應(yīng)激是內(nèi)源性的抗氧化物和氧化物失衡，導(dǎo)致活性氧簇(ROS)持續(xù)產(chǎn)生導(dǎo)致的。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nuclear factor-erythroid2-related fa

49、ctor2，Nrf2)可以通過對(duì)抗血管細(xì)胞中的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用。
　　PolⅠ抑制劑能激活血管平滑肌細(xì)胞ATR-p53通路抑制平滑肌細(xì)胞的增殖，但不引起凋亡，或許是因?yàn)榧?xì)胞中某些保護(hù)性通路被激活使細(xì)胞得以存活。有證據(jù)表明，在Caenorhabditis線蟲中通過沉默WDR-46蛋白抑制核仁的正常功能，會(huì)激活由SKN-1/Nrf-CEP1/p53通路介導(dǎo)的解毒基因表達(dá)。因此，我們推測(cè)PolⅠ抑制劑可能激活血管

50、平滑肌細(xì)胞中相關(guān)的Nrf2通路，從而保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。
　　研究目的：
　　1.研究PolⅠ抑制劑CX-5461對(duì)細(xì)胞Nrf2通路的影響。
　　2.探索Nrf2在PolⅠ抑制劑CX-5461影響平滑肌細(xì)胞凋亡作用中的角色。
　　研究方法..
　　1.Hela細(xì)胞和MOVAS細(xì)胞的培養(yǎng)
　　Hela和MOVAS細(xì)胞系均購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。細(xì)胞用含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2的培

51、養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)約90％時(shí)，用0.25％的胰酶消化傳代。
　　2.MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力
　　將細(xì)胞接種于無菌96孔板中，給予不同藥物處理，后按照CellTiter96Aqueous試劑操作方法，用多酶標(biāo)儀進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)。
　　3.構(gòu)建pGL4.26-ARE質(zhì)粒
　　根據(jù)ARE序列設(shè)計(jì)DNA鏈，且DNA兩端分別有KpnⅠ和BglⅡ酶切位點(diǎn)。用以上兩種內(nèi)切酶對(duì)載體質(zhì)粒pGL4.26進(jìn)行酶切，將DNA片段

52、連入載體片段中，形成含有Luciferase報(bào)告基因和Hygromycin B抗性的質(zhì)粒。
　　4.質(zhì)粒提取
　　在冰上融化一份DH5a感受態(tài)，將質(zhì)粒與其混合，冰浴30min后置入42℃水浴鍋中90s，迅速將其轉(zhuǎn)移至冰上。加入SOC培養(yǎng)基后于37℃搖床中孵育90min。取適菌液鋪板，37℃培養(yǎng)過夜。次日挑取單克隆菌株，用LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)12-16h。將收集的菌液離心，用QIAGEN質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。測(cè)得質(zhì)粒濃度和純度

53、后儲(chǔ)存于-20℃。
　　5.瓊脂糖凝膠電泳
　　按照DNA分子量選擇配置合適濃度的瓊脂糖凝膠。在電泳槽中加滿TAE電泳緩沖液，將凝膠放入電泳槽中，有孔的一側(cè)靠近負(fù)極。將DNA樣品按5∶1和DNA loading buffer混合，加入凝膠孔中，以100V恒壓進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后UV下觀察凝膠。
　　6.DNA回收
　　在UV下，將含有所需DNA片段的凝膠切下，稱重后置入1.5ml EP管中。用QIAGEN DNA

54、回收試劑盒回收DNA，檢測(cè)DNA濃度和純度，儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?br>　　7.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
　　接種細(xì)胞于無菌培養(yǎng)板中，待密度達(dá)約70％進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以24孔板為例，用50μl Opti-Mem稀釋適量DNA，將2μl Lipo2000稀釋于等體積的Opti-MEM中，室溫孵育5min后將DNA和lipo2000溶液混勻，室溫孵育30min。將混合液逐滴加入換用無抗生素培養(yǎng)基的細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)，次日換以新鮮培養(yǎng)基。
　　8.Nrf

55、2-reporter穩(wěn)定細(xì)胞系篩選
　　細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿，將構(gòu)建的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞中。48h后換以含有200μ g/ml Hygromycin B的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。每日換液，當(dāng)細(xì)胞數(shù)目由少變多時(shí)，用無菌槍頭挑取單個(gè)細(xì)胞簇至新的六孔板中，繼續(xù)用含Hygromycin B的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。重復(fù)上述步驟挑取細(xì)胞簇至新的六孔板中，待細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)傳代，并凍存細(xì)胞株。
　　9.熒光素酶檢測(cè)
　　將細(xì)胞接

56、種于96孔板中，給予不同藥物處理后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞，每孔加入40μl裂解液，于-80℃反復(fù)凍融3次使細(xì)胞完全破裂。將裂解液移入白色96孔板中，每孔加入50μl熒光素酶檢測(cè)試劑，混勻后用酶標(biāo)儀檢測(cè)luciferase水平。
　　10.蛋白免疫印跡
　　提取細(xì)胞蛋白并用BCA試劑盒檢測(cè)濃度，根據(jù)樣品蛋白濃度調(diào)整上樣量。經(jīng)過恒壓電泳和恒流轉(zhuǎn)膜后，用5％BSA封閉硝酸纖維素膜，TBST洗滌后4℃過夜孵育Nrf2一抗。次

57、日用TBST洗膜后，室溫孵育相應(yīng)抗性的二抗2h，用LAS-4000化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)。
　　11.Caspase3/7活性檢測(cè)
　　將細(xì)胞接種于96孔板中，藥物處理結(jié)束后，加入用DMEM培養(yǎng)基和Caspase3/7試劑1∶1混合配置的檢測(cè)液，37℃孵育30min后，將檢測(cè)液移入白色96孔板中，用酶標(biāo)儀檢測(cè)Caspase3/7活性數(shù)值。
　　12.免疫熒光檢測(cè)
　　將細(xì)胞接種于8孔腔式載玻片，藥物處理結(jié)束后，用冰乙醇固

58、定細(xì)胞，5％BSA封閉，4℃孵育Nrf2—抗過夜，次日37℃孵育相應(yīng)抗性的594-免疫熒光二抗30min。進(jìn)行DAPI染色后用共聚焦顯微鏡進(jìn)行圖像采集。
　　13.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)分析使用非配對(duì)t檢驗(yàn)或方差分析以及Newman-Keuls兩兩檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。認(rèn)為P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.Nrf2-依賴的ARE報(bào)告基因質(zhì)粒及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建
　　將構(gòu)建好

59、的pGL4.26-ARE質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞，用Nrf2激活劑sulforaphane處理細(xì)胞后，測(cè)得luciferase水平升高。加抗生素篩選后得到穩(wěn)定表達(dá)Nrf2-reporter的細(xì)胞系。用te rt-butylhydroquinone(tBHQ)處理Nrf2-reporter細(xì)胞系，能引起luciferase水平升高。
　　2.PolⅠ抑制劑對(duì)Nrf2的影響
　　用PolⅠ抑制劑CX-5461處理Nrf2-repo

60、rter細(xì)胞，能引起luciferase水平升高，提示Nrf2通路被激活;用CX-5461處理pGL4.26-ARE質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MOVAS平滑肌細(xì)胞，luciferase檢測(cè)和免疫熒光檢測(cè)提示CX-5461能激活MOVAS細(xì)胞中的Nrf2。
　　3.Nrf2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
　　用特異性Nrf2抑制劑4F抑制Nrf2后，用CX-5461處理MOVAS細(xì)胞，檢測(cè)Caspase3/7活性。結(jié)果提示CX-5461單獨(dú)處理不引起顯著的

61、凋亡，而用Nrf2抑制劑和CX-5461聯(lián)合處理細(xì)胞能引起細(xì)胞凋亡水平明顯升高。
　　4.其他靶向p53的化療藥物對(duì)Nrf2通路的影響
　　除CX-5461外，我們還檢測(cè)了幾種新型的p53通路激活劑對(duì)Nrf2的作用。Inauhzin、Tenovin6、BMH-21處理Nrf2-reporter細(xì)胞均能引起luciferase水平升高，提示以上藥物均能激活Nrf2通路。而MI773、JNJ-26754165、Doxorubic