G蛋白信號調(diào)控蛋白12在心肌肥厚中的作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　心肌肥厚是一個多分子、多信號通路參與的復雜病理生理過程，可能導致心力衰竭、猝死等嚴重心血管事件，但是目前對于心肌肥厚發(fā)生發(fā)展的分子機制的認識仍十分有限。G蛋白信號通路調(diào)節(jié)蛋白(RGS)家族多個成員被發(fā)現(xiàn)參與心肌肥厚的病理生理過程。RGS12是分子量最大、功能結(jié)構(gòu)域最多的RGS家族成員。結(jié)構(gòu)的復雜性決定了RGS12可以發(fā)揮更復雜和更精密的分子調(diào)控作用。本研究旨在闡明RGS12對心肌肥厚的影響及其具體機制。
　　方法

2、:
　　第一部分:選取野生型(WT)小鼠及Sprague-Dawley大鼠乳鼠心肌細胞作為研究對象，分別采用胸主動脈縮窄術(AB)和血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)處理建立在體心肌肥厚和離體心肌細胞肥大模型，運用Western blot檢測造模后各時間點心肌組織、心肌細胞和成纖維細胞內(nèi)RGS12表達水平。
　　第二部分:選取全系統(tǒng)RGS12基因敲除(RGS12-KO)小鼠和WT小鼠作為研究對象，采用AB構(gòu)建心肌肥厚模型。手術4周后檢

3、測相關指標:取材小鼠心臟、肺臟和左側(cè)脛骨，計算心體比(HW/BW)、心脛比(HW/TL)和肺體比(LW/BW);采用H&E、WGA、PSR等病理染色評價心肌細胞橫截面積及膠原沉積水平;超聲成像儀檢測小鼠心臟功能;應用實時定量PCR檢測心肌肥厚和纖維化標志物水平。
　　第三部分:選取心臟特異性RGS12轉(zhuǎn)基因（RGS12-CTG）小鼠和CAG-(loxP)CAT(loxP)-RGS12/α-MHC-MerCreMer雙轉(zhuǎn)基因(CRM

4、C)小鼠作為研究對象，采用AB構(gòu)建心肌肥厚模型。手術4周后檢測相關指標:取材小鼠心臟、肺臟和左側(cè)脛骨，計算HW/BW、HW/TL和LW/BW;采用H&E、WGA、PSR等病理染色評價心肌細胞橫截面積及膠原沉積水平;超聲成像儀檢測小鼠心臟功能;應用實時定量PCR檢測心肌肥厚和纖維化標志物水平。
　　第四部分:利用腺病毒轉(zhuǎn)染手段，構(gòu)建RGS12低表達(AdshRGS12)或高表達(AdRGS12)乳鼠心肌細胞，以腺病毒載體AdshRN

5、A和AdGFP轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細胞作為相應的對照組，分別運用AngⅡ和內(nèi)皮素(ET-1)構(gòu)建離體心肌細胞肥大模型。促肥厚因子干預48小時后檢測相關指標:采用免疫熒光染色比較測量心肌細胞表面積;應用實時定量PCR檢測心肌肥厚標志物水平。
　　第五部分:分別在動物實驗和細胞實驗中，運用Western blot檢測各組小鼠心臟組織或心肌細胞中MAPK信號通路分子的總量和磷酸化水平變化。然后，以Sprague-Dawley大鼠乳鼠心肌細胞為研

6、究對象，采用AngⅡ干預構(gòu)建離體心肌細胞肥大模型，運用免疫共沉淀檢測RGS12與信號通路關鍵分子的相互作用。最后，以RGS12-TG和CRMC小鼠作為研究對象，采用AB構(gòu)建心肌肥厚模型，使用信號通路分子特異性抑制干預小鼠。手術4周后檢測相關指標:取材小鼠心臟、肺臟和左側(cè)脛骨，計算HW/BW、HW/TL和LW/BW;采用H&E、WGA、PSR等病理染色評價心肌細胞橫截面積及心肌纖維化程度;超聲成像儀檢測小鼠心臟功能。
　　結(jié)果:

7、r>　　第一部分:在體心肌肥厚模型和離體心肌細胞肥大模型中，心肌肥厚標志物表達水平明顯升高。與假手術組(Sham)相比，AB組小鼠心肌組織內(nèi)RGS12蛋白表達量明顯提高，且手術8周后的表達水平高于手術4周后。與在體實驗類似，AngⅡ干預24小時和48小時后，心肌細胞內(nèi)RGS12的蛋白質(zhì)水平逐漸升高。然而，AngⅡ干預后，成纖維細胞內(nèi)RGS12蛋白水平無明顯變化。
　　第二部分:WT和RGS12-KO小鼠行假手術造模后，兩組小鼠的心

8、臟大小、纖維化程度、心臟功能及相關基因表達水平無明顯差異。AB構(gòu)建心肌肥厚模型4周后，取材結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RGS12-KO小鼠的HW/BW、HW/TL和LW/BW小于WT小鼠;病理染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RGS12-KO小鼠的心臟大小、心肌細胞橫截面積、間質(zhì)和血管周圍膠原沉積以及膠原容積低于WT小鼠;心臟超聲結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RGS12-KO小鼠的左心腔擴大和左心收縮功能減低程度好于WT小鼠;RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RGS12-KO小鼠的心肌肥厚標志物的mR

9、NA表達水平低于WT小鼠。
　　第三部分:CRMC和RGS12-CTG小鼠行假手術造模后，兩組小鼠的心臟大小、纖維化程度、心臟功能及相關基因表達水平無明顯差異。AB構(gòu)建心肌肥厚模型4周后，取材結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RGS12-CTG小鼠的HW/BW、HW/TL和LW/BW高于CRMC小鼠;病理染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RGS12-CTG小鼠的心臟大小、心肌細胞橫截面積、間質(zhì)和血管周圍膠原沉積以及膠原容積大于CRMC小鼠;心臟超聲結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RGS12-CT

10、G小鼠的左心腔擴大和左心收縮功能減低程度較CRMC小鼠加重;RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RGS12-CTG小鼠的心肌肥厚標志物的mRNA表達水平高于CRMC小鼠。
　　第四部分:PBS干預AdshRGS12、AdshRNA、AdRGS12和AdGFP組乳鼠心肌細胞48小時后，各組乳鼠心肌細胞表面積和相關基因表達水平無明顯差異。AngⅡ干預48小時后，免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AdshRGS12組心肌細胞表面積小于AdshRNA組，而Ad

11、RGS12組心肌細胞表面積大于AdGFP組;RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AdshRGS12組心肌肥厚標志物的mRNA表達水平低于AdshRNA組，而AdRGS12組心肌肥厚標志物mRNA的表達水平高于AdGFP組。
　　第五部分:促肥厚刺激不影響絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路分子的蛋白質(zhì)總量，卻引起MAPK信號通路分子的磷酸化程度升高。其中，JNK1/2和P38的磷酸化程度不受RGS12表達水平的影響，而RGS12高表達提高

12、MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平，RGS12低表達降低MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平。同時，AngⅡ干預后，RGS12能夠在心肌細胞內(nèi)與MEK1/2結(jié)合形成功能復合體。在RGS-CTG和CRMC小鼠心肌肥厚模型中，MEK1/2特異性抑制劑(U0126)干預能夠顯著降低小鼠的HW/BW、HW/TL和LW/BW，改善小鼠心肌肥厚、心肌細胞橫截面積增大、間質(zhì)和血管周圍膠原沉積，緩解左心腔擴大和左心收縮功能減低。更為重要的是，這些