G蛋白偶聯(lián)受體激酶在胚胎發(fā)育中調(diào)控作用的研究.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)是細(xì)胞表面最大的一類受體超家族,它能夠介導(dǎo)多種多樣的配體信號(hào),包括激素、神經(jīng)遞質(zhì)、氣味及其它小分子,調(diào)節(jié)廣泛的生理功能和藥物作用,同時(shí)也是多種疾病臨床治療的靶點(diǎn)。G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G protein-coupled receptor kinases,GRKs)是調(diào)節(jié)GPCR的一類關(guān)鍵的絲/蘇氨酸激酶。它能夠特異性結(jié)合被激動(dòng)劑激活的受體,迅速磷酸化受體的胞內(nèi)

2、段,抑制受體的持續(xù)激活,介導(dǎo)受體內(nèi)吞和脫敏。GRK有七種亞型(GRK1～7),分為三個(gè)亞家族。其中研究較多的是GRK2和GRK5。這兩類GRK廣泛分布于全身多種器官,對(duì)多種GPCR具有選擇性的調(diào)節(jié)作用,參與調(diào)節(jié)多種多樣的生理現(xiàn)象和病理過程。GRK2和GRK5都擁有保守的催化結(jié)構(gòu)域,同時(shí)也各有特點(diǎn):GRK2是GRK家族中唯一一個(gè)基因缺失胚胎致死的成員,其作用機(jī)制尚不清楚;GRK5及其同亞家族成員因擁有一段核定位序列,而在細(xì)胞漿和細(xì)胞核均有

3、分布,但其核內(nèi)功能卻尚未明確。
　　以往的研究主要集中在GRK2和GRK5對(duì)分化、發(fā)育成熟的機(jī)體、組織的調(diào)節(jié)功能上,GRK在胚胎發(fā)育過程中的作用還研究得較少。明確GRK這類生理功能、信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白在胚胎發(fā)育中的作用,將有助于指導(dǎo)胚胎期用藥,并且對(duì)于防止胚胎發(fā)育異常有著重要意義。我們的研究以斑馬魚為模型,結(jié)合人類細(xì)胞上的機(jī)制探討,主要揭示GRK2和GRK5對(duì)胚胎發(fā)育的調(diào)控作用。
　　研究發(fā)現(xiàn):
　　1、GRK2和

4、GRK5在斑馬魚胚胎發(fā)育早期都有高表達(dá);在斑馬魚胚胎中分別下調(diào)GRK2和GRK5,都會(huì)引起胚胎發(fā)育的缺陷。其中,GRK2下調(diào)引起胚胎早期發(fā)育遲滯和細(xì)胞周期G2/M期停滯;GRK5下調(diào)主要影響正常的胚胎造血。不僅過表達(dá)野生型的GRK2或GRK5能夠緩解內(nèi)源蛋白下調(diào)導(dǎo)致的發(fā)育缺陷,其激酶活性缺失的突變體K220R和K215R也有明顯的緩解作用,提示:GRK對(duì)于胚胎早期發(fā)育的調(diào)控不依賴其激酶活性。
　　2、酵母雙雜交結(jié)果提示,GRK2可

5、以與cyclinB1調(diào)節(jié)蛋白PTCH1相互作用;基因芯片結(jié)果提示,GRK5可能對(duì)調(diào)節(jié)造血的轉(zhuǎn)錄因子GATA2有調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明,GRK2與PTCH1之間、GRK5與GATA2之間確實(shí)存在相互作用;并且通過免疫共沉淀篩查,找出了各自的結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),包含GRK2與PTCH1結(jié)合位點(diǎn)的小片段:BP對(duì)GRK2下調(diào)引起的胚胎早期發(fā)育遲滯和細(xì)胞周期G2/M期停滯均有明顯的緩解作用,而結(jié)合功能缺失的突變體△312-379則沒有這種效應(yīng);G

6、RK5與GATA2結(jié)合功能缺失的點(diǎn)突變R216L不能緩解GRK5下調(diào)所引起的造血功能障礙,其包含結(jié)合位點(diǎn)的小片段M130甚至還有顯性失活突變體的作用。提示,GRK2與GRK5分別通過結(jié)合PTCH1和GATA2調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育。
　　3、PTCH1的激動(dòng)劑Hedgehog(ShhN)刺激促進(jìn)GRK2結(jié)合PTCH1,減弱cyclinB1與PTCH1的相互作用。GRK2、K220R和BP都能促使cyclinB1與PTCH1解離,促進(jìn)cycl

7、inB1從細(xì)胞漿進(jìn)入細(xì)胞核,而△312-379則不能。提示,GRK2通過與PTCH1相互作用,促使cyclinB1與PTCH1解離,促進(jìn)cyclinB1回到細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和胚胎發(fā)育。
　　4、GRK5、K215R以及GRK2核定位的突變體NLS-GRK2均能促進(jìn)GATA2在細(xì)胞核內(nèi)積聚,并且增強(qiáng)GATA2的轉(zhuǎn)錄活性;而R216L和核定位缺陷的GRK5突變體NES-GRK5則不能。提示,GRK5主要通過結(jié)合GATA2

8、,在核內(nèi)積聚GATA2,促進(jìn)GATA2的轉(zhuǎn)錄功能。
　　綜上所述,我們的研究發(fā)現(xiàn)了GRK2和GRK5在胚胎發(fā)育過程中、與成體不同的重要調(diào)節(jié)作用,探討了兩者各自的調(diào)節(jié)機(jī)制。其中,GRK2主要通過直接結(jié)合cyclinB1的調(diào)節(jié)蛋白PTCH1,從而促使cyclinB1與PTCH1解離,增加cyclinB1入核,促進(jìn)cyclinB1介導(dǎo)的細(xì)胞周期和胚胎發(fā)育;GRK5則通過結(jié)合GATA2,使GATA2在核內(nèi)積聚,增強(qiáng)GATA2的轉(zhuǎn)錄活性,促