組蛋白脫甲基酶LSD1在小鼠胚胎干細(xì)胞分化及斑馬魚胚胎發(fā)育中的作用.pdf

1、組蛋白賴氨酸脫甲基酶Lsd(Lysine-specificdemethylase1)催化H3K4mel/2或H3K9me1/2脫甲基化從而調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與基因轉(zhuǎn)錄。隨著表觀遺傳學(xué)的飛速發(fā)展，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到表觀遺傳調(diào)控在發(fā)育分化與疾病發(fā)生中起著重要的作用。組蛋白賴氨酸甲基化與脫甲基化介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控是發(fā)育分化過程中表觀遺傳調(diào)節(jié)的重要組成部分，然而Lsd1在其中的具體作用尚不清楚。因此，我們分別以小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonicstem

2、cells，EScells)與斑馬魚為體外和體內(nèi)模型，采用RNA干擾、Morpholino反義核酸、化學(xué)抑制劑處理、基因芯片、染色質(zhì)免疫沉淀等實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究LSd1在發(fā)育分化中的作用。
　　我們采用慢病毒介導(dǎo)的shRNA在小鼠ES細(xì)胞中成功的下調(diào)了Lsd1的表達(dá)，結(jié)果顯示：①下調(diào)Lsd1表達(dá)不影響ES細(xì)胞的自我更新：細(xì)胞形態(tài)以及多能性標(biāo)志基因Oct4、Nanog、Sox2與Rex1的表達(dá)水平未發(fā)生顯著改變。②在EB(embryoni

3、cbody，擬胚體)分化過程中加入Lsd1的H3K4me1/2脫甲基酶活性抑制劑TCP(Tranylcypromine，反式環(huán)苯丙胺)，紅細(xì)胞標(biāo)志基因Globin等的表達(dá)被顯著抑制，但內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志基因VE-Cadherin等的表達(dá)沒有變化，胚胎早期發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)也沒有明顯變化。③下調(diào)Lsd1表達(dá)顯著抑制EB分化過程的中胚層細(xì)胞發(fā)育分化：早期中內(nèi)胚層標(biāo)志基因Brachyury的表達(dá)被延遲，造血/內(nèi)皮祖細(xì)胞標(biāo)志基因Flk1，造血祖細(xì)胞標(biāo)

4、志基因Scl、紅系祖細(xì)胞標(biāo)志基因Gatal及紅細(xì)胞標(biāo)志基因Globin等的表達(dá)被顯著抑制。④染色質(zhì)免疫沉淀檢測(cè)顯示EB分化過程中LSdl可以結(jié)合在cKit基因的啟動(dòng)子區(qū)域，TCP處理引起EB10天時(shí)造血相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域H3K4me2水平上升。⑤基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示下調(diào)Lsd1表達(dá)導(dǎo)致中胚層發(fā)育延遲，早期中胚層標(biāo)志基因在EB6天仍然高表達(dá)。我們的研究結(jié)果證明Lsd1調(diào)節(jié)胚胎早期的發(fā)育分化，其中對(duì)原始造血分化的調(diào)節(jié)作用依賴于H3K4me1

5、/2脫甲基酶活性。
　　以斑馬魚為模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：①TCP處理的斑馬魚胚胎在30hpf時(shí)出現(xiàn)“無(wú)血(Bloodless)”表型，而用帕吉林(Pargyline)和丙酰芐胺異煙肼(Nialamide)處理則不引起類似表型。②進(jìn)一步檢測(cè)顯示TCP抑制原始紅細(xì)胞生成，但對(duì)血管發(fā)生沒有顯著影響；TCP處理的Tg(gatal：EGFP)斑馬魚胚胎在30hpf時(shí)血液循環(huán)中EGFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目減少，并且胚胎globin基因表達(dá)減少。③克隆表

6、達(dá)純化了zLsd1的C端161-867a.a.(含SWIRM與FAD結(jié)構(gòu)域，GST-zLsd1161-867a.a)，脫甲基酶活性測(cè)試顯示體外重組表達(dá)的GST-zLsd1161-867a.a具有H3K4me2脫甲基酶活性，并且TCP可以抑制體外重組表達(dá)的GST-zLsd1161-867a.a對(duì)H3K4me2的脫甲基酶活性。④注射干擾zLsd1mRNA正常剪接的反義核酸(lsd1-MO)也導(dǎo)致斑馬魚胚胎在30hpf時(shí)出現(xiàn)“無(wú)血”表型、血液

7、循環(huán)中g(shù)ata1：EGFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目減少，胚胎gtobm基因表達(dá)減少。⑤基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示注射lsd1-MO的斑馬魚胚胎在24hpf時(shí)胚胎globin基因的表達(dá)均被抑制，其它一些紅細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)也被抑制。
　　我們?cè)趦煞N生物學(xué)模型中的研究結(jié)果均表明Lsd1在胚胎發(fā)育與細(xì)胞分化中發(fā)揮著重要的作用：Lsd1調(diào)節(jié)中胚層發(fā)育分化及原始紅細(xì)胞生成。Lsd1對(duì)早期中胚層發(fā)育分化的作用不依賴于H3K4me1/2脫甲基酶活性，但對(duì)原始