G蛋白偶聯(lián)受體激酶2在肝細胞癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其可能機制.pdf

1、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)已經(jīng)成為全球第五大常見惡性腫瘤,其死亡率在所有惡性腫瘤中居第三位。研究發(fā)現(xiàn) HCC對傳統(tǒng)抗癌療法,如放療和化療具有高度耐受,因此,有關(guān) HCC的治療新策略和有效預(yù)防方案仍迫切需要。G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G protein-coupled receptor kinases,GRKs)屬于絲/蘇氨酸激酶家族,是人體內(nèi)一類重要的激酶,參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)多種信號通路。研究表明,GRK

2、s通過調(diào)節(jié)一些G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)和非GPCR信號通路參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而,GRKs在HCC侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其可能的作用機制尚不清楚。前列腺素受體EP2屬于GPCRs,已有文獻報道,EP2受體介導(dǎo)多種腫瘤的血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),EP2受體選擇性激動劑 Butaprost,能夠明顯刺激 HCC細胞的增殖和遷移。本實驗在以往研究基礎(chǔ)上,首先收

3、集臨床標本,分析比較GRK2和GRK3在HCC患者肝臟腫瘤組織、非瘤組織及不同分化程度肝癌組織之間的表達差異;整體動物實驗部分,采用腹腔注射二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠的肝癌模型,檢測了不同造模時間小鼠肝臟 GRK2、GRK3和EP2的表達變化;體外實驗選取轉(zhuǎn)移潛能不同的人 HCC細胞株,從細胞和分子水平探討 GRK2和GRK3在不同轉(zhuǎn)移潛能人 HCC細胞株中的表達差異及 EP2的

4、分布變化,并采用針對 GRK2的小干擾 RNA(small interfering RNA,siRNA)干擾 HCC細胞株中 GRK2基因表達,進一步探討 GRK2在 HCC侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)機制。
　　目的:收集臨床 HCC患者肝臟標本,并建立 DEN誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型,觀察分析肝臟 GRK2和GRK3的表達情況;體外選取不同轉(zhuǎn)移潛能 HCC細胞株檢測GRK2、GRK3和EP2的表達,并應(yīng)用 GRK2 siRNA轉(zhuǎn)染 HC

5、C細胞株,明確GRK2在HCC侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)機制。
　　方法:選取行肝癌切除術(shù)的72例 HCC患者的肝癌組織石蠟標本,及17例肝內(nèi)膽管結(jié)石患者的石蠟標本作為正常對照,通過免疫組化方法檢測了不同分化程度肝癌組織中GRK2和GRK3的表達變化;同時收集臨床18例HCC患者術(shù)中新鮮肝臟組織標本,qPCR和Western blot法檢測肝組織中GRK2和GRK3表達水平的變化。于出生14天的C57BL/6J小鼠腹腔注射 DEN建

6、立肝癌模型,根據(jù)造模的時間,設(shè)正常對照組(0w)和模型組(8、16、24、32、40w),并以Western blot法檢測肝臟中 GRK2和GRK3表達水平的變化,免疫組化法檢測 EP2的表達情況。體外選用轉(zhuǎn)移潛能由低到高的人 HCC細胞株(HepG2、SMMC-7721、MHCC97L、MHCC97H和HCCLM3)和永生型人肝細胞株 L02,采用 Western blot法和激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測 GRK2、GRK3和EP2

7、表達分布情況;進一步運用針對 GRK2 siRNA轉(zhuǎn)染 HCC細胞株,設(shè)置空白對照組和陰性對照組,qPCR和Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后 GRK2表達的變化,并以細胞劃痕法和Transwell法檢測轉(zhuǎn)染后細胞的移行能力和侵襲能力變化;同時,Western blot法檢測干擾后HCC細胞中ERK1/2、p-ERK1/2、Akt和p-Akt表達水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1.GRK2和GRK3在HCC患者肝臟中的表達變

8、化
　　免疫組織化學(xué)染色法檢測 HCC患者肝癌組織和肝內(nèi)膽管結(jié)石患者肝臟組織標本,結(jié)果顯示,GRK2在肝內(nèi)膽管結(jié)石患者肝臟組織中的表達明顯高于HCC患者肝臟組織,低分化 HCC患者的肝癌組織中 GRK2的表達水平幾乎成陰性,明顯
　　低于高分化HCC患者;而GRK3在不同分化程度HCC患者肝臟組織中的表達無明顯差異。qPCR和Western-blot結(jié)果顯示,HCC患者腫瘤組織中 GRK2的表達明顯低于非瘤組織,而GRK3的

9、表達在腫瘤組織和非瘤組織中差異并不明顯。
　　2.GRK2和GRK3在DEN誘導(dǎo)的肝癌模型小鼠肝臟中的表達情況
　　Western blot檢測結(jié)果顯示,在 DEN誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型中,隨著造模時間的延長,GRK2的表達水平逐漸降低,GRK3的表達無明顯差異。同時,免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn),肝癌模型小鼠肝臟EP2的表達明顯強于正常小鼠。
　　3.GRK2、GRK3和EP2在不同轉(zhuǎn)移潛能HCC細胞株中的分布和表達情況
　　

10、Western blot檢測結(jié)果顯示 GRK2在正常肝細胞中表達較高,在 HCC細胞中隨著轉(zhuǎn)移潛能的增加,其表達逐漸降低,而 GRK3的表達在不同細胞系中沒有明顯差異。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),GRK2、EP2主要分布在胞漿和胞膜,且 GRK2在正常肝細胞中的熒光強度要強于 HCC細胞;選擇性的EP2受體激動劑Butaprost刺激 HCC細胞株后,細胞膜上EP2熒光明顯增強。超速離心法分離胞漿和胞膜蛋白,Western blot檢

11、測結(jié)果顯示,Butaprost刺激30min后,與轉(zhuǎn)移潛能較低的HepG2細胞相比,轉(zhuǎn)移潛能較高的HCCLM3細胞膜上 EP2表達較強,而GRK2表達較弱。
　　4.轉(zhuǎn)染針對GRK2 siRNA對人SMMC-7721細胞遷移和侵襲能力的影響
　　GRK2在不同轉(zhuǎn)移潛能HCC細胞系中的表達差異提示其可能與轉(zhuǎn)移相關(guān)。在SMMC-7721細胞轉(zhuǎn)染 GRK2 siRNA后,GRK2的mRNA和蛋白表達均比對照組明顯降低。細胞劃痕實驗

12、結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后 SMMC-7721細胞的24h劃痕愈合面積與對照組相比顯著增加;同時Transwell統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染后SMMC-7721細胞的穿膜個數(shù)與對照組相比明顯增多,侵襲能力明顯增強。
　　5.轉(zhuǎn)染針對GRK2 siRNA對人SMMC-7721細胞ERK1/2、p-ERK1/2、Akt和p-Akt信號分子的影響
　　Western-blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染 GRK2 siRNA后,SMMC-7721細胞中 p-

13、ERK1/2水平?jīng)]有明顯的變化,而p-Akt水平明顯增高,提示低表達GRK2可能促進EP2受體信號下游的Akt通路的激活。
　　結(jié)論:
　　1.在不同分化程度的HCC患者肝臟組織標本中,GRK3的表達沒有明顯變化,而低分化 HCC患者肝臟組織中 GRK2的表達明顯低于高分化 HCC患者組織。在DEN誘導(dǎo)的肝癌模型小鼠肝臟組織中,GRK2的表達隨造模時間的延長而逐步減少,GRK3的表達則沒有明顯變化。這些結(jié)果提示GRK2可能是

14、抑制HCC發(fā)展的重要分子。
　　2.體外實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),在不同轉(zhuǎn)移潛能的人HCC細胞株中,GRK2的表達隨著轉(zhuǎn)移潛能逐漸升高而逐漸降低,GRK3則沒有明顯變化,提示低表達 GRK2可能與HCC細胞的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。選擇性的EP2受體激動劑Butaprost刺激HCC細胞株后,高轉(zhuǎn)移潛能細胞株細胞膜上的GRK2表達低,而EP2膜表達增加。這些結(jié)果提示可能由于 GRK2對 EP2受體信號下調(diào)能力的減弱,致 HCC細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移增強。