肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移相關(guān)LncRNAs篩選及其作用機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，特別是在亞洲、非洲，肝癌發(fā)病率明顯高于其它地區(qū)，并且肝癌致死率在我國(guó)惡性腫瘤中高居第二位;而肝癌中，肝細(xì)胞癌(HCC)大約占80％。因此探究肝細(xì)胞癌相關(guān)的癌基因或抑癌基因，研究肝細(xì)胞癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)肝細(xì)胞癌的預(yù)防、診斷和治療等均具有重要的實(shí)際意義。目前臨床手術(shù)切除或者肝移植仍是治療肝細(xì)胞癌最有效的治療方法，但是一方面由于肝癌發(fā)病速度快，惡性程度高，多數(shù)患者在肝癌早期并沒(méi)有明顯的臨床癥狀，大多

2、數(shù)病人確診時(shí)已屬于肝癌晚期，錯(cuò)過(guò)了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)，限制了手術(shù)治療手段的應(yīng)用;另一方面肝細(xì)胞癌易擴(kuò)散轉(zhuǎn)移、術(shù)后易復(fù)發(fā)，導(dǎo)致肝細(xì)胞癌患者的術(shù)后生存期較短，影響手術(shù)治療的效果。和其他惡性腫瘤相同，肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因參與、多步驟的、復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，其中涉及到了許多基因的改變、腫瘤微環(huán)境等因素導(dǎo)致了肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的的惡性轉(zhuǎn)化。雖然，目前全世界已經(jīng)嘗試用高通量技術(shù)篩選技術(shù)對(duì)肝細(xì)胞癌的功能基因的突變譜及差異表達(dá)譜進(jìn)行了研究，但目

3、前臨床上沒(méi)有很好的診斷標(biāo)志分子及治療靶標(biāo)。之前的大部分研究一直是以蛋白質(zhì)編碼基因?yàn)檠芯繉?duì)象，隨著非編碼RNA研究的逐漸深入及高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，近十年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)基因組可以編碼大量長(zhǎng)片段的非編碼RNA，它們?cè)谏顒?dòng)及疾病發(fā)生中的作用也逐漸得到揭示。目前為止，在肝細(xì)胞癌中仍沒(méi)有篩選到可以用于臨床的診斷或預(yù)后的lncRNA分子。因此本研究采用基因表達(dá)譜芯片高通量技術(shù)并輔以生物信息學(xué)分析及實(shí)驗(yàn)技術(shù)篩選、驗(yàn)證與肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的長(zhǎng)

4、鏈非編碼RNA(lncRNA)，并探討其可能的臨床意義。
　　本文第一章，我們通過(guò)采用博奧生物集團(tuán)有限公司的人類長(zhǎng)鏈非編碼RNA芯片對(duì)3對(duì)已經(jīng)轉(zhuǎn)移的肝細(xì)胞癌組織與癌旁組織及3對(duì)未發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝細(xì)胞癌組織與癌旁組織中l(wèi)ncRNA的差異表達(dá)譜進(jìn)行篩選，得到與肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA。在轉(zhuǎn)移組肝癌樣本中，我們發(fā)現(xiàn)179個(gè)lncRNA上調(diào)（例如HOXD-AS1和GOLGA2P10），76個(gè)lncRNA下調(diào)(例如HOTAIR)。然后

5、我們對(duì)篩選得到的顯著差異lncRNA在44例(20例未發(fā)生轉(zhuǎn)移，24例發(fā)生轉(zhuǎn)移)肝細(xì)胞癌組織及癌旁組織中進(jìn)行驗(yàn)證。我們篩選到的一條具有較好臨床意義的假基因編碼的GOLGA2P10 Transcript1，其具有良好的臨床相關(guān)性，并且TCGA中361例肝細(xì)胞癌病人的臨床數(shù)據(jù)顯示其可以作為HCC預(yù)后的候選標(biāo)志分子(p=0.00512)。
　　第二章，我們著重探討GOLGA2P10在肝癌細(xì)胞中的的生物學(xué)功能和分子機(jī)制。我們通過(guò)細(xì)胞功能實(shí)

6、驗(yàn)證實(shí)GOLGA2P10可以促進(jìn)SMMC-7721、L02細(xì)胞增殖與遷移，但在HepG2細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)該促進(jìn)效應(yīng)。為了進(jìn)一步闡明GOLGA2P10的分子機(jī)制，我們分析了GOLGA2P10的細(xì)胞定位和下游信號(hào)通路。我們首先運(yùn)用RT-PCR及FISH技術(shù)對(duì)GOLGA2P10在細(xì)胞內(nèi)的定位分布進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其主要定位于細(xì)胞核中;然后我們運(yùn)用表達(dá)譜芯片篩選GOLGA2P10影響的下游基因及信號(hào)通路，并運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)篩選得到的差異基因進(jìn)行GO

7、分析、IPA分析，最后結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明了GOLGA2P10可以上調(diào)FZD3、FZD6，激活Wnt信號(hào)通路，進(jìn)而引起級(jí)聯(lián)反應(yīng):上調(diào)MMP7促進(jìn)細(xì)胞遷移;上調(diào)c-Myc，及其下游靶基因GLS1引起細(xì)胞代謝改變（脂代謝、谷氨酰胺代謝），增強(qiáng)SMMC-7721細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的能量供應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞生存、增殖及遷移，而在細(xì)胞系HepG2中（HepG2中CTNNB1發(fā)生突變，缺少調(diào)控其降解的Ser/Thr結(jié)構(gòu)域，因此不受上游信號(hào)調(diào)控

8、），則不能激活Wnt信號(hào)通路，從側(cè)面證明了我們的結(jié)論。因此GOLGA2P10可能是部分HCC病人的潛在治療靶標(biāo)。根據(jù)已有的RNA pulldown-質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)合在FZDs的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，我們推測(cè)GOLGA2P10應(yīng)該是通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子CTBP1介導(dǎo)增強(qiáng)子與啟動(dòng)子之間的相互作用促進(jìn)FZD3、FZD6表達(dá)，但仍然需要RIP、CHIP及IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　第三章是研究HOXD-AS1促進(jìn)肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的作用

9、機(jī)制，本課題組之前的一項(xiàng)研究證實(shí)HOXD-AS1在肝細(xì)胞癌中異常高表達(dá)，細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)證明其可以顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞系的遷移能力，我們對(duì)其具體機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)HOXD-AS1在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中均有分布，其可以通過(guò)多種機(jī)制參與肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移。我們的結(jié)果證明HOXD-AS1可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-19a促進(jìn)ARHGAP11A上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRNA-19a在肝細(xì)胞癌組織樣本中下調(diào)表達(dá)，ARHGAP11A