肝癌組織中酪氨酸磷酸化蛋白篩選及其在肝細(xì)胞癌中轉(zhuǎn)移機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）在我國惡性腫瘤病死率中排第二，高發(fā)于東南沿海區(qū)域。我國每年新增肝癌病人13余萬例，占全世界每年新增病人的40％～50％。
　　肝癌的治療方法，分為外科治療與非外科治療。外科治療主要有三種方法：外科切除；外科消融治療及肝移植。外科切除是療效最好的治療方法，但是總體手術(shù)切除率低，復(fù)發(fā)率高。外科消融治療以其侵襲性小、操作簡便的顯著優(yōu)勢，但消融

2、治療即使完全殺滅腫瘤，術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)率仍高達(dá)24％～49％。第三種方法是肝移植，可是肝供體極為缺乏，因此不能成為主要治療手段。除了以上的外科方法，還有另外的一些治療手段，例如放化療、中醫(yī)治療、生物療法。這三種方法通常會(huì)聯(lián)合使用，但效果都比較有限。
　　除了治療效果有限外，更為重要的是至今為止原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制還不明了。因此，闡明肝癌侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)生的分子機(jī)制，特別是其轉(zhuǎn)移機(jī)制，為將來建立相應(yīng)的阻斷途徑及建立治療靶點(diǎn)具有重要意

3、義。
　　腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、多階段的演化過程，它受多種因素的調(diào)節(jié)。腫瘤通常以四種方法轉(zhuǎn)移，直接蔓延法；淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移法；血液系統(tǒng)轉(zhuǎn)移法，癌細(xì)胞脫落后種植法。
　　研究表明，細(xì)胞骨架蛋白的分布與腫瘤的轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，它們主要由微管、肌動(dòng)蛋白纖維（actin filament）和中間絲三類蛋白質(zhì)纖維組成。其中，肌動(dòng)蛋白纖維主要參與細(xì)胞形態(tài)的維持，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞、細(xì)胞分裂、基因表達(dá)和細(xì)胞分化。
　

4、　細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的起始是細(xì)胞偽足的形成，肌動(dòng)蛋白纖維的成核反應(yīng)是啟動(dòng)細(xì)胞偽足形成的關(guān)鍵。這個(gè)反應(yīng)受 Arp2/3復(fù)合物調(diào)節(jié)，而 Arp2/3復(fù)合物受到 WASP蛋白家族成員（Wiskott-Aldrich syndrome family protein）調(diào)控，該蛋白家族包括 WASP、N-WASP、WAVE1、WAVE2和WAVE3。
　　Nck是WASP家族蛋白的其中一個(gè)重要的結(jié)合蛋白，又稱銜接蛋白（adaptor protein）。

5、它具有一個(gè)SH2（Src homology domain）結(jié)構(gòu)域和三個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域。其中SH2主要是接受細(xì)胞內(nèi)、外酪氨酸磷酸激酶信號(hào)。酪氨酸磷酸化蛋白是一種關(guān)系到細(xì)胞的增殖，生長，分化，粘連的蛋白，它是細(xì)胞信號(hào)通路中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)器，在腫瘤發(fā)生發(fā)展以及腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用。SH2結(jié)合酸磷酸信號(hào)后，再通過SH3與WASP-Arp2/3復(fù)合物結(jié)合，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)控。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)是目前迅速發(fā)展的一門學(xué)科。能夠高通

6、量、大規(guī)模地研究正常和病理情況下細(xì)胞，組織中蛋白質(zhì)表達(dá)及翻譯的變化，可篩選用于疾病診斷、治療及預(yù)后的生物標(biāo)志物等，使得它正成為生物醫(yī)學(xué)中的研究熱點(diǎn)。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)廣泛應(yīng)用于血液，尿液，唾液等組織的研究。
　　GST pull-down是體外研究蛋白間相互作用的方法之一，應(yīng)用也非常廣泛。
　　綜上所述，我們構(gòu)建了Nck1-SH2融合蛋白并采用GST-Nck1-SH2 pull down分別在非HCC組織與HCC組織中捕獲與N

7、ck1-SH2相互作用的蛋白，再結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)一步尋找差異表達(dá)的蛋白，最后研究差異蛋白在肝癌細(xì)胞遷移中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Nck1-SH2結(jié)合蛋白在HCC組織中明顯高于非HCC組織。質(zhì)譜鑒定出以下13種蛋白：Cytoplasmic protein NCK1, Dermcidin1(DCD), Dermcidin precursor, Actin(aortic smooth muscle), Engulment and

8、 cell motility protein（ELMO1）, Longevity assurance homolog2,60S acidic ribosomal protein P2, Carbonyl reductase(NADPH)1, E3 ubiquitin-protein ligase, Actin(cytoplasmic1),Heat shock70kDa protein1等。
　　生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)以上大部分蛋白多為

9、轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、酶類等，其中差異蛋白Dermcidin（DCD）是一種潛在的致癌因子，有研究表明它可能和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，于是我們對它進(jìn)行重點(diǎn)研究。我們比較DCD在肝癌組織，非HCC組織，肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示DCD在肝癌組織及高轉(zhuǎn)運(yùn)的癌細(xì)胞中是表達(dá)明顯升高；我們也驗(yàn)證了在肝癌組織及肝癌細(xì)胞中，均存在DCD-Nck的相互作用，且DCD-Nck的相互作用是依賴于DCD的酪氨酸磷酸化；最后應(yīng)用遷移實(shí)驗(yàn)（Transwell

10、）驗(yàn)證DCD-Nck的相互作用能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移、激活肝癌細(xì)胞的Rac1的活性， DCD-Nck的相互作用是DCD誘導(dǎo)的Rac1激活和肝癌細(xì)胞遷移的必要條件。
　　我們的研究結(jié)果進(jìn)一步闡明了肝癌侵襲轉(zhuǎn)移分子機(jī)制，可能為今后肝癌的臨床治療提供新的治療靶點(diǎn)。
　　第一部分蛋白質(zhì)組學(xué)篩選Nck1-SH2相互作用蛋白
　　一、目的：
　　通過GST-Nck1-SH2 pull down及蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選非HCC組織與

11、HCC組織中的Nck相互作用的差異蛋白。
　　二、方法：
　　一方面構(gòu)建GST-Nck1-SH2融合蛋白；另一方面提取非HCC組織和HCC組織總蛋白，將GST-Nck1-SH2融合蛋白與肝組織總蛋白共同孵育，去除雜質(zhì)后進(jìn)行雙向電泳。利用 ImageMaster軟件尋找差異蛋白，選取差異蛋白點(diǎn)，膠內(nèi)酶解后行肽指紋圖譜分析及生物信息學(xué)分析，鑒定差異蛋白。
　　三、結(jié)果：
　　通過GST-Nck1-SH2 pull d

12、own及2D clear up等技術(shù)，獲得理想的樣本，并成功進(jìn)行下游的雙向電泳技術(shù)，得到理想的雙向電泳圖譜。選擇T/N>2倍的蛋白點(diǎn)15個(gè)，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，鑒定出13種蛋白差異蛋白。分別是：Nance-Horan syndrome protein, Cytoplasmic protein NCK1, Engulment and cell motility protein1（Elmo1）, Actin(aortic smooth muscl

13、e), Dermcidin(DCD), Dermcidin precursor，60S acidic ribosomal protein P2, DPI of Desmoplakin, Heat shock70kDa protein1， Max binding protein, Carbonyl reductase(NADPH)1, E3 ubiquitin-protein ligase, Actin(cytoplasmic1), Lo

14、ngevity assurance homolog2等。經(jīng)分析，以上大部分蛋白是參與物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量代謝的酶類、細(xì)胞骨架蛋白、分子伴侶等。
　　四、小結(jié)：
　　成功利用GST-Nck1-SH2 pull down獲得與NCK相關(guān)的蛋白并利用雙向電泳技術(shù)進(jìn)行分離，質(zhì)譜分析鑒定出13個(gè)可能對肝癌侵襲轉(zhuǎn)移有影響的蛋白。
　　第二部分 DCD-Nck相互作用在肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究
　　一、目的：
　　驗(yàn)證差異

15、蛋白DCD在非HCC組織，肝癌組織，肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，同時(shí)體外驗(yàn)證DCD-Nck相互作用在肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移中所起到的作用及其機(jī)制。
　　二、方法：
　　應(yīng)用Western blot等技術(shù)驗(yàn)證DCD在各種肝癌細(xì)胞株，肝癌組織及非HCC組織中的表達(dá)情況；用4G10抗體檢測DCD-Nck的相互作用是否依賴于DCD的酪氨酸磷酸化；采用co-IP技術(shù)及GST pull down驗(yàn)證在肝癌組織及肝癌細(xì)胞中DCD-Nck相互作用；應(yīng)用遷

16、移實(shí)驗(yàn)（Transwell）檢測DCD對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響；檢測Rac1活性。
　　三、結(jié)果：
　　DCD在高轉(zhuǎn)運(yùn)的肝癌細(xì)胞株中表達(dá)明顯高于低轉(zhuǎn)運(yùn)肝癌細(xì)胞株；在肝癌組織中的表達(dá)也顯著高于正常組織。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無論是肝癌細(xì)胞株還是肝癌組織中都存在DCD-Nck的相互作用； DCD-Nck的相互作用依賴DCD的酪氨酸磷酸化；Transwell實(shí)驗(yàn)及Rac1活性檢測分析結(jié)果表明DCD的野生株可以顯著增加肝癌細(xì)胞的遷移能

17、力和Rac1的活性，而其突變體會(huì)降低肝癌細(xì)胞的遷移能力和Rac1的活性；DCD-Nck的相互作用是DCD誘導(dǎo)Rac1激活和促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移的必要條件。
　　四、小結(jié)：
　　本研究分別檢測了DCD在肝癌細(xì)胞株及肝癌組織中的表達(dá)情況；體外驗(yàn)證了DCD-Nck確實(shí)存在相互作用，這種相互作用依賴DCD的酪氨酸磷酸化；DCD-Nck相互作用能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移、激活肝癌細(xì)胞的Rac1的活性；DCD-Nck的相互作用是DCD誘導(dǎo)的Rac

18、1激活和肝癌細(xì)胞遷移的必要條件。
　　全文結(jié)論：
　　本研究通過GST-Nck1-SH2 pull down成功獲得非HCC組織與HCC組織中Nck相互作用蛋白，然后利用雙向電泳技術(shù)，找出差異蛋白，通過質(zhì)譜分析成功鑒定出13種與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白。本研究重點(diǎn)檢測差異蛋白DCD在肝癌細(xì)胞株及肝癌組織中的表達(dá)情況，證明DCD在肝癌組織及高轉(zhuǎn)運(yùn)癌細(xì)胞中表達(dá)明顯增高。同時(shí)，我們進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)證明DCD-Nck存在相互作用，這種相互作