人肝癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移相關(guān)酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)的差異研究.pdf

1、本研究通過(guò)對(duì)不轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系(Hep3B)與具有低、高轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞系(MHCC97L/MHCC97H)的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)表達(dá)譜差異分析，找到與HCC轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)的關(guān)鍵酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)分子。利用三種不同方法從不同角度篩出一些差異蛋白質(zhì)，并對(duì)其中的膜聯(lián)蛋白I進(jìn)行了再驗(yàn)證。　　第一部分人肝癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)移相關(guān)酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)的差異分析。優(yōu)化雙向凝膠電泳，蛋白印跡及酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)富集相關(guān)技術(shù)，建立相對(duì)穩(wěn)定、適合本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)

2、平臺(tái)，聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)，篩查在肝癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用的差異酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)分子。采用三種不同的方法，從不同角度和層面對(duì)三種具有不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞系中酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)分析：(1)用2-DE+蛋白印跡+MALDI-TOF-MS/MS。(2)用免疫沉淀(差異條帶)+MALDI-TOF-MS/MS。(3)用免疫沉淀(全酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì))+LC-ESI-MS/MS?！　〉诙糠洲D(zhuǎn)移潛能不同人肝癌細(xì)胞系中差異酪氨酸磷酸化

3、蛋白質(zhì)的再驗(yàn)證。為保證差異酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)篩選結(jié)果的可信度及下游分析的確定性，我們選取差異蛋白質(zhì)中的膜聯(lián)蛋白Ⅰ進(jìn)行了再驗(yàn)證，應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、蛋白印跡和細(xì)胞免疫化學(xué)技術(shù)證實(shí)膜聯(lián)蛋白Ⅰ的確在有轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)。結(jié)論：1.通過(guò)對(duì)2-DE、酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)富集技術(shù)的摸索和優(yōu)化，聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)建立了適合篩查磷酸化蛋白質(zhì)的技術(shù)平臺(tái)。2.建立了不轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系Hep3B的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)表達(dá)譜。3.與