基于離心式富集裝置和抗體的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化分析新方法.pdf

1、蛋白質(zhì)組學(xué)是大規(guī)模、高通量、系統(tǒng)化研究某種細(xì)胞、組織或生物體中所有蛋白質(zhì)的組成及其功能的學(xué)科。翻譯后修飾對蛋白質(zhì)的功能和活性起至關(guān)重要的作用，因此，蛋白質(zhì)組學(xué)研究不僅包括蛋白質(zhì)的定量、定性分析，還包括蛋白質(zhì)的修飾種類和修飾位點(diǎn)鑒定。目前常見的蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略有兩種：“Top-down”和“Bottom-up”?！癟op-down”以完整蛋白質(zhì)為研究對象，通過對完整蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的測定和碎裂譜圖的解讀，實(shí)現(xiàn)對其序列覆蓋率100％的測定。

2、“Bottom-up”是目前應(yīng)用最為廣泛的蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略，它的流程是將復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣品酶解成肽段，再通過色譜等方法將其分離后，進(jìn)一步使用液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS/MS）進(jìn)行分析，通過碎裂譜圖與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的匹配情況來鑒定肽段，從而獲得相應(yīng)蛋白質(zhì)的信息。該策略非常適用于大規(guī)模分析鑒定復(fù)雜蛋白質(zhì)組樣本。近幾十年來，質(zhì)譜技術(shù)不斷發(fā)展，尤其是生物質(zhì)譜廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分析鑒定，為蛋白質(zhì)組研究提供了高通量、快速、精確、靈敏的檢測方法。隨著蛋

3、白質(zhì)組學(xué)研究不斷深入，應(yīng)用也愈發(fā)廣泛。通過對生命活動過程中蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾和功能調(diào)節(jié)機(jī)制的異常進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究，人們能夠深入認(rèn)識生命的生理過程和病理變化，從而期診斷和預(yù)后提供分子標(biāo)志物。
　　酪氨酸磷酸化作為一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾已成為近年來組學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。酪氨酸磷酸化及其激酶參與調(diào)控多個重要的生物過程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞凋亡、血管生成、細(xì)胞遷移、基因轉(zhuǎn)錄和代謝反應(yīng)等。它是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵因子，且在腫瘤

4、的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵性作用。酪氨酸磷酸化及其激酶活性的研究在抗腫瘤藥物靶點(diǎn)的研發(fā)中具有十分重要的意義。然而，由于酪氨酸磷酸化僅占蛋白質(zhì)總磷酸化含量的不足0.1%，因此規(guī)模化的酪氨酸磷酸化鑒定面臨著重大技術(shù)挑戰(zhàn)。常見的酪氨酸磷酸肽富集方法主要有金屬氧化物親和色譜和抗酪氨酸磷酸化抗體免疫沉淀。然而，這兩種方法均存在一定缺陷。二氧化鈦無偏性地將絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸肽富集出來，往往鑒定結(jié)果中僅含有1%~2%的酪氨酸磷酸肽，大量的非酪氨酸磷

5、酸肽在質(zhì)譜檢測時會抑制酪氨酸磷酸肽的信號；抗體免疫沉淀的方法雖然是針對酪氨酸磷酸肽特異性富集的方法，但應(yīng)用于復(fù)雜樣品時，由于樣品的高度復(fù)雜性和抗體親和力的有限性，導(dǎo)致抗體富集時也會存在大量非特異性吸附肽段。針對這些難題，我們建立了一種先以二氧化鈦富集磷酸肽，再以抗體富集酪氨酸磷酸肽的富集策略。我們發(fā)展了一種用于磷酸肽富集的新型離心式富集裝置，該裝置使二氧化鈦串聯(lián)反相填料，將磷酸肽的富集、清洗、洗脫和分離通過自制的離心裝置集成一體。在此基

6、礎(chǔ)上，結(jié)合抗體免疫沉淀建立了酪氨酸磷酸肽的富集新策略。該富集裝置簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，減少了樣品損失和人為因素干擾；而且離心式、平行化的樣品處理方式可顯著提高分析通量。為了得到了最優(yōu)的富集方法，我們對這種策略的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行細(xì)致的考察和優(yōu)化。首先是磷酸肽富集方法的優(yōu)化，在離心式富集裝置的基礎(chǔ)上，我們考察了包括酶切肽段與TiO2的質(zhì)量比，洗脫液的乙腈比例，結(jié)果表明，當(dāng)酶切肽段與TiO2的質(zhì)量比為1:4，洗脫液乙腈比例分別為2%、5%、8%、10%

7、、40%時，富集效果較好。1 mg鼠肝蛋白中可鑒定到磷酸化位點(diǎn)10793個，對應(yīng)7333個磷酸化修飾肽段。在此基礎(chǔ)上，我們研究了抗體富集實(shí)驗(yàn)條件，包括不同公司的抗體，起始蛋白量，抗體清洗方式等。我們將優(yōu)化后的策略成功用于小鼠肝臟蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化肽段的富集和質(zhì)譜鑒定，共計鑒定849個酪氨酸磷酸化肽，對應(yīng)545個蛋白質(zhì)，其蛋白功能與文獻(xiàn)報道的已知酪氨酸磷酸化修飾蛋白功能相符。這為深入研究酪氨酸磷酸化修飾提供了有力支持，顯示了該富集策略在蛋

8、白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用潛力。
　　肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國最常見的腫瘤之一，死亡率僅次于肺癌。大多數(shù)肝癌患者在確診時已失去手術(shù)切除的機(jī)會，因此尋找有效的肝癌藥物治療靶點(diǎn)以及早期診斷的標(biāo)志物具有重要意義。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，比較正常和病理狀態(tài)下的肝癌細(xì)胞或組織中酪氨酸磷酸化蛋白的表達(dá)和修飾量的差異，對發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)特異性靶點(diǎn)具有重要意義，可為肝癌的臨床診斷、病理研究、藥物靶點(diǎn)篩選提供理論

9、依據(jù)和基礎(chǔ)。
　　我們以小鼠肝臟為樣品建立的酪氨酸磷酸肽富集策略應(yīng)用于人的肝癌組織和其癌旁組織的酪氨酸磷酸肽富集與鑒定。從77例肝癌病人的癌組織中共鑒定到970個非冗余的酪氨酸磷酸化蛋白，1492個酪氨酸磷酸化位點(diǎn)；從癌旁組織中鑒定到962個非冗余的酪氨酸磷酸化蛋白，1424個酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。這一數(shù)據(jù)有助于深入研究酪氨酸磷酸化修飾在肝臟生理病理過程中的調(diào)節(jié)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證明自制的離心式富集裝置和抗體結(jié)合的酪氨酸磷酸肽富集策