Rab27B參與肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一種常見的、致死率極高的惡性腫瘤,每年約650,000人死于HCC,且其發(fā)病率有逐漸增高的趨勢。HCC的轉(zhuǎn)移是影響其術(shù)后治療效果和預(yù)后的最大障礙,是導(dǎo)致HCC高死亡率的主要原因。HCC的轉(zhuǎn)移主要是肝內(nèi)轉(zhuǎn)移,肝臟外部轉(zhuǎn)移很少見。HCC的轉(zhuǎn)移是一個(gè)連續(xù)、漸進(jìn)的多因素、多步驟動(dòng)態(tài)的過程。目前,盡管對(duì)HCC轉(zhuǎn)移進(jìn)行了大量研究,發(fā)現(xiàn)了一些與HCC轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子,但都是對(duì)某一分子

2、與HCC轉(zhuǎn)移的關(guān)系的研究,僅僅從某一個(gè)側(cè)面證明了其與HCC轉(zhuǎn)移的關(guān)系,并沒有從整體上分析和了解HCC轉(zhuǎn)移過程及其發(fā)生機(jī)制,所以HCC轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制并不清楚。
　　前期研究發(fā)現(xiàn)Rab27B分子在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株表達(dá)上調(diào),因此可作為潛在的HCC轉(zhuǎn)移標(biāo)志物進(jìn)行深層次的功能驗(yàn)證。Rab GTPase是機(jī)體內(nèi)一組的與內(nèi)膜運(yùn)輸相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白,其中Rab27亞族包括兩個(gè)成員:Rab27A和Rab27B。Rab27B主要通過其效應(yīng)分子的相互作用來發(fā)揮

3、功能,其主要功能是參與大多數(shù)分泌性細(xì)胞的胞吐作用及運(yùn)輸過程。
　　為了進(jìn)一步研究Rab27B參與HCC轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,我們采用RNAi技術(shù)抑制HCC細(xì)胞系中Rab27B的表達(dá),以確定其是否與HCC轉(zhuǎn)移相關(guān),并探索其參與HCC轉(zhuǎn)移的機(jī)制,在此基礎(chǔ)上通過臨床樣本驗(yàn)證其能否作為診斷HCC轉(zhuǎn)移的候選標(biāo)志物。本研究選取具有較高轉(zhuǎn)移能力的HCC細(xì)胞株HCC97H作為細(xì)胞模型,首先通過構(gòu)建針對(duì)Rab27B的特異性的shRNA質(zhì)粒載體,通過轉(zhuǎn)染H

4、CC97H,篩選到特異性抑制Rab27B表達(dá)的shRNA,并經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定敲低Rab27B的HCC97H細(xì)胞株-shRab27B細(xì)胞株,與此同時(shí)也得到陰性對(duì)照穩(wěn)定細(xì)胞株-mock細(xì)胞株,通過RT-PCR及Western Bloting鑒定其Rab27B的表達(dá)水平與正常HCC97H細(xì)胞相比顯著下降。
　　HCC的轉(zhuǎn)移過程中涉及到細(xì)胞的增殖、黏附、遷移和侵襲等方面的性質(zhì),因此本研究也從這幾個(gè)方面進(jìn)行。首先,在體外通過實(shí)驗(yàn)比較s

5、hRab27B、mock和HCC97H細(xì)胞株的增殖、黏附、遷移和侵襲能力,結(jié)果顯示穩(wěn)定敲低Rab27B的HCC97H細(xì)胞株shRab27B細(xì)胞與mock及HCC97H細(xì)胞相比,其體外貼壁增殖、黏附、遷移和侵襲能力均顯著下降,這說明Rab27B表達(dá)量的降低抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程,也即體外實(shí)驗(yàn)證明Rab27B與HCC的轉(zhuǎn)移過程相關(guān)。隨后,進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)即裸鼠荷瘤轉(zhuǎn)移模型進(jìn)行驗(yàn)證,通過向裸鼠脾臟接種shRab27B和mock細(xì)胞,觀察腫瘤的肝

6、臟轉(zhuǎn)移及肺臟轉(zhuǎn)移情況,接種細(xì)胞8周后mock組肝臟腫瘤轉(zhuǎn)移灶質(zhì)量要顯著大于shRab27B組,且接種shRab27B組肝臟轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)的時(shí)間要顯著晚于mock組的出現(xiàn)時(shí)間,這表明Rab27B表達(dá)的降低抑制了HCC97H細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)確定Rab27B與HCC的轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　在確定Rab27B與HCC轉(zhuǎn)移相關(guān)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討其參與HCC轉(zhuǎn)移的機(jī)制,即其是如何調(diào)控HCC轉(zhuǎn)移過程的。Rab27B主要參與

7、調(diào)控細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸過程,在細(xì)胞內(nèi)囊泡定位運(yùn)輸至胞膜的過程中發(fā)揮了重要作用,因此,我們推斷Rab27B表達(dá)量的降低抑制了HCC97H細(xì)胞的囊泡分泌過程,從而降低了參與HCC轉(zhuǎn)移的重要分子的分泌量。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,可知在胞外分泌蛋白中,shRab27B細(xì)胞分泌的尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)和肝細(xì)胞生長因子(HGF)的量與mock和HCC97H細(xì)胞相比顯著下降,uPA和HGF及其受體在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要的作用。因此,我們確定HCC9

8、7H細(xì)胞中Rab27B表達(dá)量的降低抑制了uPA和HGF的分泌過程,從而抑制了HCC97H細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程。
　　隨后收集不同時(shí)期HCC病人臨床血清,通過ELISA實(shí)驗(yàn)測定Rab27B的表達(dá)量,在已發(fā)生轉(zhuǎn)移的HCC病人血清中Rab27B的含量要顯著高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的,因此Rab27B可作為診斷HCC轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物用于臨床診斷。
　　本課題采用RNAi技術(shù)建立穩(wěn)定敲低Rab27B表達(dá)水平的HCC97H細(xì)胞株,通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)確證Ra