褪黑素-MICU1在心肌肥厚中的作用及機制研究.pdf

1、目的：1.研究線粒體MICU1在病理性心肌肥厚中的具體作用;2.明確抑制[Ca2+]m超載是否是MICU1發(fā)揮心肌保護作用的重要內(nèi)在機制;3.探明線粒體MICU1及其調(diào)節(jié)的[Ca2+]m變化是否介導(dǎo)了Melatonin的心肌保護作用。
　　方法：在C57BL6/J小鼠背部皮下植入含血管緊張素-Ⅱ的微量滲透泵(Ang-Ⅱ，1000ng/kg/min)，以0.11μl/h的速率泵入Ang-Ⅱ28天從而構(gòu)建心肌肥厚動物模型。(1)利用小

2、動物超聲檢測心臟功能;(2)根據(jù)Masson染色的操作流程檢測小鼠心肌纖維化程度;(3)根據(jù)H&E染色的操作流程檢測心臟大小;(4)采用Western blotting分別檢測心肌組織及線粒體中MICU1蛋白表達水平變化;200nM Ang-Ⅱ干預(yù)小鼠原代心肌細胞（neonatal mice ventricular myocyte，NMVMs）48h以構(gòu)建心肌肥厚細胞模型。(1)根據(jù)免疫熒光（α-actinin）染色來測定心肌細胞平均橫

3、截面積;(2)采用qRT-PCR檢測心肌細胞中ANP、BNP、α-MHC，β-MHC表達水平變化;(3)線粒體形態(tài)變化通過透射電鏡進行檢測;(4)線粒體ATP含量及線粒體膜電位水平分別由ATP試劑盒與JC-1試劑盒測定;(5)分別采用原子火焰吸收法和激光共聚焦檢測[Ca2+]m含量。
　　結(jié)果：1.通過小動物超聲、H&E染色、Masson染色、α-actinin染色、qRT-PCR等檢測方式發(fā)現(xiàn)，心肌肥厚動物模型及細胞模型構(gòu)建成功

4、。2.皮下植入含Ang-Ⅱ的微量滲透泵28天后，取左心室心肌組織用于各種檢測。Western blotting結(jié)果顯示，心肌組織MICU1明顯降低;與此同時，線粒體MICU1也出現(xiàn)明顯降低的趨勢。3.為了探明線粒體MICU1在心肌肥厚中的具體作用，我們通過心肌點注射技術(shù)制備了心臟MICU1降低小鼠模型。小動物超聲發(fā)現(xiàn)，下調(diào)MICU1明顯惡化了心臟功能，具體表現(xiàn)為左室射血分?jǐn)?shù)和左室縮短分?jǐn)?shù)均明顯降低，而左室后壁舒張期厚度顯著增加。H&E染

5、色及大體指標(biāo)表明，MICU1缺失增加了心臟體積，心體比和肺體比。同時，馬松染色結(jié)果也提示，MICU1缺失明顯增加了心肌組織的纖維化水平。在細胞實驗中，MICU1的降低增加了細胞平均橫截面積，增加了ANP、BNP、α-MHC，β-MHC的表達。為了進一步驗證這些發(fā)現(xiàn)，我們通過腺病毒轉(zhuǎn)染，成功增加了心臟組織中MICU1的表達。
　　結(jié)果：發(fā)現(xiàn)，過表達MICU1能夠逆轉(zhuǎn)前文所述的各種變化，減輕心肌肥厚。4.心肌細胞中MICU1缺失不但惡

6、化了Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的線粒體形態(tài)損傷（嵴模糊與膜崩解），而且加劇了線粒體功能的抑制(ATP生成減少與膜電位降低)。[Ca2+]m超載被認為是導(dǎo)致心肌損傷的一個重要因素。通過原子火焰法和激光共聚焦發(fā)現(xiàn)，MICU1減少導(dǎo)致肥厚心肌細胞中Ca2+超載。然而，透射電鏡結(jié)果提示，過表達MICU1維持了肥厚條件下的線粒體形態(tài)完整性。ATP試劑盒與JC-1試劑盒檢測結(jié)果表明，MICU1上調(diào)明顯改善了肥厚條件下的線粒體功能。更重要的是，MICU1上調(diào)也同

7、樣減輕了[Ca2+]m超載。5.Melatonin干預(yù)明顯增加了心肌組織中線粒體MICU1的表達。但是，luzindole(一種非特異性的Melatonin受體阻斷劑)與Melatonin同時干預(yù)則顯著抑制了肥厚心肌中MICU1的表達。這些結(jié)果表明，Melatonin是受體依賴性的增加了心肌組織中MICU1的表達。為闡明Melatonin與MICU1在病理性心肌肥厚中的具體關(guān)系，我們分別研究了Melatonin在心肌MICU1正常與缺失

8、小鼠中的生物學(xué)作用。
　　結(jié)果：表明，在心肌肥厚條件下，Melatonin減輕了線粒體損傷、改善了心臟功能、抑制了纖維化修補。但是，MICU1缺失消除了Melatonin的上述心肌保護作用。
　　結(jié)論：1.病理性心肌肥厚抑制了線粒體MICU1的表達;2.線粒體MICU1通過改善線粒體損傷、抑制心肌纖維化、減輕心臟功能損傷從而發(fā)揮心肌保護作用;3.線粒體損傷與Ca2+超載是介導(dǎo)MICU1缺失加重心肌肥厚的關(guān)鍵內(nèi)在機制;4.Me