Cathepsin V參與HMGB1促進血管新生作用.pdf

1、目的:探討HMGB1促進人臍靜脈內皮細胞血管新生的作用機制以及內源性蛋白酶對其促血管新生作用的調控。
　　方法:采用內皮細胞成管功能分析不同干預藥物對內皮細胞成管功能的促進或抑制作用。采用蛋白質印記法檢測細胞內外蛋白水平的變化。采用細胞免疫熒光染色法檢測細胞內蛋白水平及細胞膜表面受體水平。采用重組HMGB1、蛋白酶抑制劑SID26681509、HMGB1-TLR4/MD2抑制劑Tetramer、TLR4抑制劑viper、Erk磷酸

2、化抑制劑U0126、沙奎那韋等藥物干預人臍靜脈內皮細胞以評價內皮細胞成管功能及細胞蛋白表達變化。通過藥物刺激和siRNA干擾的方法研究基因及蛋白作用:
　　(1)應用蛋白酶抑制劑SID抑制蛋白酶cathepsinⅤ的作用;
　　(2)應用Tetramer抑制HMGB1-TLR4特異性信號轉導;
　　(3)應用viper抑制與TLR4有關的信號轉導;
　　(4)應用U0126抑制細胞內Erk磷酸化過程;
　　

3、(5)應用siRNA干擾細胞內HMGB1等蛋白的表達。
　　結果:研究發(fā)現(xiàn)缺氧過程中內皮細胞核內的HMGB1大量移位、釋放到細胞外。rHMGB1（1μg/ml）促進內皮細胞成管功能，siRNA干擾HMGB1表達后，內皮細胞成管功能下降。rHMGB1促進內皮細胞ERK磷酸化，且其作用呈現(xiàn)雙相，即短時效應（30分鐘內）和長時效應（3小時以上）。ERK磷酸化抑制劑U0126抑制內皮細胞的成管功能。
　　rHMGB1刺激后的內皮細胞

4、表面TLR4表達增加。TLR4抑制劑Viper可以抑制內皮細胞的成管功能及ERK磷酸化。HMGB1-TLR4/MD2作用的特異性抑制劑Tetramer同樣能抑制內皮細胞的成管功能及ERK磷酸化。Viper及Tetramer均能抑制rHMGB1與內皮細胞的結合。
　　缺氧環(huán)境下，內皮細胞中的CathepsinⅤ釋放到細胞外，且rHMGB1刺激時其釋放增加。HMGB1-TLR4/MD2特異性抑制劑Tetramer及ERK磷酸化抑制劑U

5、0126均可抑制CathepsinⅤ的釋放。CathepsinⅤ的抑制劑SID抑制內皮細胞成管及HMGB1誘導的內皮成管及ERK磷酸化，但并不影響rHMGB1與內皮細胞的結合。
　　Saquinavir抑制內皮細胞成管。在不同的時間點(6h，12h，24h)，Saquinavir能夠抑制CathepsinⅤ的釋放。類似于SID，Saquinavir能抑制內皮細胞ERK磷酸化過程但不抑制rHMGB1與內皮細胞的結合。
　　結論