APE1在放療誘導肺癌血管生成中的作用及機制研究.pdf

1、肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤和癌癥死亡的主要原因，近30年生存改善并不明顯。目前85%以上的肺癌患者為非小細胞肺癌，手術、放療和化療是治療非小細胞肺癌最常用的三種方式。隨著放射腫瘤學的不斷發(fā)展，放療已經(jīng)逐漸成為多種類型惡性腫瘤局部治療的重要方法，也是目前治療非小細胞肺癌最有效的方法之一。然而肺癌單獨放療的療效是令人失望的，部分腫瘤會因放療抵抗出現(xiàn)局部控制失敗，更重要的是腫瘤對放療并不是完全被動的。目前許多研究表明放療可能促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)

2、移，其機制之一與血管生成和促血管生成因子有關。放療可以同時刺激多個信號傳導通路，改變VEGF等多種促血管生成因子在殘存腫瘤細胞和宿主細胞的表達。此過程可能涉及多個基因，但具體機制目前仍不完全清楚。放療聯(lián)合多基因多靶點的抗腫瘤治療已成為目前研究的新方向。
　　 APE1具有DNA損傷修復和氧化還原等多種功能，是VEGF等促血管生成因子的上游基因。我們實驗室前期研究已經(jīng)證實APE1對骨肉瘤血管生成具有調(diào)節(jié)作用及APE1在肺癌中表達增

3、高和亞細胞定位改變與化療抵抗有關。因此，我們推測APE1對肺癌血管生成和放療誘導肺癌血管生成可能具有調(diào)節(jié)作用。本研究首先檢測APE1與VEGF在非小細胞肺癌腫瘤組織中的表達，分析APE1與非小細胞肺癌腫瘤血管生成和預后的關系，然后進一步通過體外實驗觀察人肺腺癌A549細胞APE1和VEGF表達與放射線照射的劑量效應關系，并利用Ad5/F35-APE1 siRNA抑制A549細胞APE1表達，研究APE1在放射誘導A549細胞VEGF表達

4、和對內(nèi)皮細胞遷移及微血管形成能力影響中的作用。
　　 研究目的
　　 1.探討APE1在非小細胞肺癌中與腫瘤血管生成和預后的關系，分析APE1成為非小細胞肺癌抗腫瘤血管生成治療靶點的可能性；
　　 2.探討APE1在放療誘導非小細胞肺癌血管生成中的作用及機制；
　　 3.探討以APE1為靶點抑制放療誘導肺癌血管生成聯(lián)合放療治療非小細胞肺癌的可能性和臨床應用價值。
　　 研究內(nèi)容和方法
　　

5、 1.APE1在非小細胞肺癌腫瘤組織中的表達及其與腫瘤血管生成和預后的關系：采用免疫組化法檢測非小細胞肺癌腫瘤組織APE1和VEGF表達，并測定MVD，分析APE1、VEGF與MVD的關系，并分析三者及常見臨床病理因素與DFS的關系。
　　 2.肺癌細胞APE1和VEGF表達與放射線照射的劑量效應關系：采用8MV X射線分別給予A549細胞2、4、6、8、10Gy單次照射，照射后48h Western blot檢測各組A549細

6、胞APE1蛋白表達和ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清液中的VEGF蛋白，以及照射后24h RT-PCR檢測各組A549細胞VEGF mRNA，分析A549細胞APE1和VEGF表達與X射線照射劑量的關系。
　　 3.Ad5/F35-APE1siRNA抑制放射誘導肺癌血管生成的實驗研究：采用重組腺病毒載體Ad5/F35-APE1 siRNA感染A549細胞，照射后48h Western blot檢測APE1蛋白表達驗證APE1抑制情

7、況，再分別給予8MV X射線2、4、6、8、10Gy單次照射，照射后48h ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白，8MV X射線4Gy單次照射Ad5/F35-APE1 siRNA感染和未感染A549細胞，照射后24小時RT-PCR檢測各組A549細胞VEGF mRNA水平，用同樣處理后48h A549細胞培養(yǎng)上清液作為條件培養(yǎng)基與HUVEC進行Transwell雙室共培養(yǎng)和管狀結構形成實驗，觀察APE1在放射線照射A549細胞

8、誘導HUVEC遷移及微血管形成中的作用。
　　 研究結果：
　　 1.APE1在非小細胞肺癌腫瘤組織中的表達及其與腫瘤血管生成和預后的關系：APE1、VEGF在NSCLC腫瘤組織中高表達率分別為77.94%和66.18%。APE1表達與性別、年齡、病理類型、分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉(zhuǎn)移無關(P>0.05)，VEGF表達和MVD值與腫瘤大小和淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關(P<0.05)。APE1與VEGF、APE1與MVD和VEG

9、F與MVD均呈正相關(r=0.369，P=0.000；r=0.256，P=0.003；r=0.387，P=0.000)。Kaplan-Meier單因素生存分析顯示腫瘤大小、淋巴結轉(zhuǎn)移及APE1、VEGF、MVD與DFS密切相關(P<0.05)。COX回歸模型多因素分析顯示，腫瘤大小、淋巴結轉(zhuǎn)移和VEGF表達是影響NSCLC患者DFS的獨立危險因素。
　　 2.肺癌細胞APE1和VEGF表達與放射線照射的劑量效應關系：Wester

10、n Blot顯示不同劑量X射線照射后48h A549細胞APE1蛋白水平均較未照射細胞明顯增加，RT-PCR結果顯示不同劑量X射線照射后24h A549細胞VEGF mRNA均較未照射細胞明顯增高，ELISA方法檢測顯示不同劑量X射線照射后48h A549細胞培養(yǎng)上清液中根據(jù)細胞數(shù)量標化的VEGF蛋白分泌量也均較未照射細胞明顯增加，并具有劑量依賴性，APE1和VEGF表達趨勢一致，而單次照射劑量超過4Gy后細胞培養(yǎng)上清液中總VEGF蛋白

11、分泌量開始出現(xiàn)下降趨勢。
　　 3.Ad5/F35-APE1siRNA抑制放射誘導肺癌血管生成的實驗研究：Ad5/F35-APE1siRNA感染A549細胞后48h Western Blot顯示A549細胞APE1蛋白表達明顯抑制，抑制率約85%，同時抑制X射線照射誘導的A549細胞APE1蛋白表達。RT-PCR和ELISA結果顯示抑制APE1表達后未照射A549細胞VEGF mRNA和VEGF蛋白分泌量均減少，抑制率大約是88

12、%和60%；抑制APE1表達后給予4Gy單次照射A549細胞VEGF mRNA水平和VEGF蛋白分泌量也降低，與單純4Gy照射細胞比較抑制率大約是88%和64%；其余不同劑量照射誘導的VEGF蛋白分泌抑制率大約是54%～65%；兩因素方差分析顯示X射線照射和APE1表達均對VEGF表達和分泌存在影響，兩者之間存在交互作用(P<0.01)。遷移實驗和管狀結構形成實驗顯示單次4Gy X射線照射后的A549細胞培養(yǎng)上清液作為條件培養(yǎng)基在體外可

13、促進血管內(nèi)皮細胞HUVEC遷移和微血管形成，Ad5/F35-APE1 siRNA抑制A549細胞APE1表達后HUVEC遷移和微血管形成的上述誘導作用明顯減弱。
　　 結論
　　 1.APE1高表達與NSCLC腫瘤血管生成有密切關系，APE1并不是影響NSCLC患者無病生存的獨立預后因素，APE1可能通過調(diào)控VEGF促進NSCLC腫瘤血管生成從而導致腫瘤復發(fā)或轉(zhuǎn)移，影響NSCLC患者無病生存預后。
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14、5/F35-APE1 siRNA抑制人肺腺癌A549細胞APE1表達后A549細胞VEGF表達和分泌下降以及血管內(nèi)皮細胞遷移和微血管形成能力降低，在體外實驗中證實APE1參與調(diào)節(jié)NSCLC腫瘤血管形成，APE1是NSCLC抗血管生成治療的潛在分子靶點，可能具有臨床應用價值。
　　 3.放射線照射以劑量依賴方式誘導A549細胞APE1和VEGF表達增強，兩者表達趨勢一致。Ad5/F35-APE1 siRNA可抑制A549細胞放射線