NOK在肺癌轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率逐年升高，然而目前仍然缺乏有效的防治手段。蛋白酪氨酸激酶已經(jīng)被證明在肺癌的發(fā)病中扮演著重要角色，酪氨酸激酶抑制劑也在肺癌的治療中取得了肯定的療效。NOK是一種新的蛋白酪氨酸激酶，目前的研究發(fā)現(xiàn)其在急性白血病、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤組織中表達(dá)，可能是一種新的候選癌基因。然而，NOK在肺癌發(fā)病中的作用尚缺乏充分的臨床證據(jù)支持，其通過(guò)何種機(jī)制參與肺癌發(fā)病、受何種信

2、號(hào)通路調(diào)節(jié)也不甚清楚。為此，本實(shí)驗(yàn)從臨床研究，細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)及機(jī)制研究三個(gè)方面探索 NOK在肺癌發(fā)病中的作用及機(jī)制，以期為肺癌的發(fā)病機(jī)制和靶向治療研究提供新的思路。
　　方法：
　　1．隨機(jī)入組2007年至2010年在第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸腔外科行手術(shù)治療的非小細(xì)胞肺癌患者191例并進(jìn)行隨訪，有以下條件之一者予以排除：接受術(shù)前化療者；接受術(shù)前放療者；接受TKIs等靶向藥物治療者。病人信息的采集包含以下要素：年齡、性別、吸煙史

3、、臨床癥狀、手術(shù)方式、腫瘤大小、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、術(shù)后病理結(jié)果。收集上述患者術(shù)中切除的腫瘤組織標(biāo)本并進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，ROC檢驗(yàn)確立陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，χ2-test法分析NOK蛋白表達(dá)與各臨床要素的相關(guān)性，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，log-rank test法分析NOK蛋白表達(dá)與患者生存時(shí)間之間的關(guān)系；Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型法分析生存時(shí)間和臨床要素之間的單因素和多因素相關(guān)性。
　　2．利用電穿孔法在肺癌A549細(xì)胞中

4、轉(zhuǎn)染NOK全長(zhǎng)質(zhì)粒，設(shè)計(jì)干涉NOK基因表達(dá)的 RNAi片段并用慢病毒包裝后感染肺癌 H520細(xì)胞，分別構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)/低表達(dá)NOK基因的肺癌細(xì)胞系。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)分析NOK過(guò)/低表達(dá)后對(duì)肺癌細(xì)胞遷移能力的影響。Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)分析NOK過(guò)/低表達(dá)后對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　3．運(yùn)用 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè) NOK過(guò)/低表達(dá)后對(duì)肺癌細(xì)胞中 EMT標(biāo)志物E-cadherin、Vimenti

5、n基因表達(dá)的影響；運(yùn)用Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NOK過(guò)/低表達(dá)后對(duì)肺癌細(xì)胞中EMT標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的影響
　　4．運(yùn)用10-9M的雌二醇刺激肺癌H520和Calu-1細(xì)胞，用qRT-PCR方法分別檢測(cè)在雌二醇刺激0h/2h/12h/24h后肺癌細(xì)胞中NOK基因的表達(dá)情況；運(yùn)用Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在雌二醇刺激0h/12h后肺癌細(xì)胞中 NOK蛋白的表達(dá)情況。利用生物信息學(xué)分析NO

6、K啟動(dòng)子區(qū)，尋找潛在的ERE結(jié)合位點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　1．NOK蛋白在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。在收集的191例肺癌組織標(biāo)本中，NOK蛋白在腫瘤組織中的陽(yáng)性率為75.4％(144/191)，在癌旁組織中的陽(yáng)性率為14.1%(27/191)。NOK的表達(dá)在腫瘤的不同病理分級(jí)（P=0.035）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.005）、pTNM分期（P=0.020）及Ki-67指數(shù)（P=0.000）分組中具有顯著的組間差異性；在不

7、同性別（P=0.371）、年齡（P=0.470）、吸煙史（P=0.618）、組織學(xué)類型（P=0.332）及pT分期（P=0.525）分組中未見(jiàn)明顯差異性。NOK蛋白表達(dá)陽(yáng)性的144例肺癌患者中位生存時(shí)間為38月（95%confidence interval[CI]=26-50月），平均生存時(shí)間為34月（95%CI=30-39月）；NOK蛋白陰性表達(dá)的47例肺癌患者平均生存時(shí)間為48月（95%CI=43-54月），中位生存時(shí)間無(wú)法求得，l

8、og-rank test統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示NOK蛋白的表達(dá)對(duì)肺癌患者的生存情況有顯著影響（P=0.004），NOK蛋白陽(yáng)性表達(dá)的肺癌患者生存時(shí)間縮短。在鱗癌患者中，NOK蛋白陽(yáng)性表達(dá)的肺癌患者較NOK蛋白陰性表達(dá)的患者生存時(shí)間更短（P=0.022）。在腺癌患者中，NOK蛋白陽(yáng)性表達(dá)的肺癌患者與NOK蛋白陰性表達(dá)的患者生存時(shí)間之間無(wú)明顯差異（P=0.054）。在pTNM I/II期肺癌患者中，NOK蛋白陰性表達(dá)的患者生存時(shí)間與陽(yáng)性表達(dá)患者之間無(wú)

9、明顯差異（P=0.061）。在pTNM III/IV分期的肺癌患者中，NOK蛋白陰性表達(dá)的患者生存時(shí)間與陽(yáng)性表達(dá)患者之間無(wú)明顯差異（P=0.144）。Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型的單因素和多因素分析結(jié)果顯示，NOK蛋白的表達(dá)是影響肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。
　　2．基因測(cè)序，qRT-PCR及Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NOK過(guò)/低表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室遷移結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)NOK基因的肺癌細(xì)胞系遷移能

10、力增強(qiáng)，低表達(dá)NOK基因的肺癌細(xì)胞系遷移能力減弱。Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)NOK基因的肺癌細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，低表達(dá)NOK基因的肺癌細(xì)胞侵襲能力減弱。
　　3．qRT-PCR及Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在過(guò)表達(dá)NOK基因的肺癌細(xì)胞系中，EMT標(biāo)志物E-cadherin的基因和蛋白表達(dá)水平降低、Vimentin基因和蛋白表達(dá)水平升高；在低表達(dá)NOK基因的肺癌細(xì)胞系中，EMT標(biāo)志物E-cadherin的基

11、因和蛋白表達(dá)水平升高、Vimentin基因和蛋白表達(dá)水平降低。
　　4．在H520細(xì)胞中加入雌激素后，NOK基因的表達(dá)水平逐漸升高，在12h時(shí)達(dá)到峰值；在Calu-1細(xì)胞中加入雌激素后，NOK基因的表達(dá)水平則逐漸降低，12h后逐步回升。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示：在距離NOK轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-1051bp，-1781bp，-2410bp存在著3個(gè)潛在的雌激素應(yīng)答原件。
　　結(jié)論：
　　1．通過(guò)臨床研究，我們發(fā)現(xiàn) NOK在肺癌組

12、織中有較高的陽(yáng)性表達(dá)率，其表達(dá)和肺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期等臨床要素相關(guān)，是影響肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。
　　2．在細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)中，我們進(jìn)一步證實(shí) NOK可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，同時(shí)其表達(dá)變化能夠影響肺癌細(xì)胞的EMT過(guò)程。
　　3．我們首次發(fā)現(xiàn)雌激素在肺癌細(xì)胞中能夠調(diào)節(jié) NOK基因的表達(dá)，這可能是雌激素參與肺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。由此我們首次提出了雌激素-NOK-EMT-肺癌轉(zhuǎn)移的新的潛在肺癌致病機(jī)制，有