leT-7a miRNA在血管平滑肌細(xì)胞增殖及移植血管內(nèi)膜增生中的作用及其機(jī)制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、前言
  慢性動脈閉塞是老齡化病人一種常見的疾病,它往往導(dǎo)致間歇性跛行,靜息痛和組織損傷。外周靜脈移植術(shù)是解決動脈閉塞的優(yōu)選方法,研究表明利用自體靜脈改善通暢情況優(yōu)于人工材料。雖然靜脈移植術(shù)的起初療效非常好,但是種種跡象表明由于內(nèi)膜增生其移植血管的管腔會逐漸狹窄甚至閉塞。最近的研究表明,手術(shù)治療的第一年內(nèi)靜脈移植的通暢率達(dá)85%-90%,然而十年內(nèi)移植靜脈再狹窄的發(fā)生率達(dá)50%。血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的增殖是在內(nèi)膜增生主要原

2、因,這是早期移植靜脈阻塞發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。
  miRNA是一種長度為18~25個核苷酸單鏈的內(nèi)源性非編碼性小RNA。它存在于多種生物的基因組中,包括從病毒到植物以及多細(xì)胞動物。miRNA最初是在線蟲中發(fā)現(xiàn)的,現(xiàn)在的研究表明miRNA在大多數(shù)生物體基因表達(dá)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。miRNA的功能是作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑,通過結(jié)合到靶mRNA調(diào)控基因的表達(dá),參與多種生物學(xué)過程,進(jìn)化過程相對保守。到目前為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人類基因組miRNAs超過150

3、0個,根據(jù)研究估計60%以上的基因可以通過miRNA來調(diào)控。因此,這些小內(nèi)源性沉默子作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑出現(xiàn)在不同的生物學(xué)過程中,如細(xì)胞增殖,發(fā)育,血管新生,膽固醇代謝,腫瘤發(fā)生或細(xì)胞凋亡等。除了miRNAs基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑的內(nèi)源性生理作用外,細(xì)胞也可被動和/或主動釋放miRNA,這種分子的旁分泌作用可以調(diào)節(jié)其他細(xì)胞的基因表達(dá)。因此,像癌癥、代謝、腦疾病或動脈粥樣硬化等疾病,都與miRNA的功能障礙有關(guān)。最近研究發(fā)現(xiàn)miRNA在血管疾病中也起著

4、重要的作用,它通過調(diào)節(jié)脈管系統(tǒng)中參與細(xì)胞活動的關(guān)鍵的靶基因來發(fā)揮作用。let-7miRNA是最早發(fā)現(xiàn)的miRNA之一,在脊椎動物和無脊椎動物中高度表達(dá)。雖然let-7在血管系統(tǒng)也表達(dá),但是其在VSMCs的增殖和移植血管中作用仍不清楚。在本研究中,通過微陣列基因芯片分析確定靜脈移植模型的microRNA表達(dá)譜。并且通過實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-timePCR)方法進(jìn)一步驗證個別失調(diào)的miRNA。我們發(fā)現(xiàn),let-7a在靜脈移植模型中

5、表達(dá)是下調(diào)。因此,我們推測,let-7a參與靜脈移植術(shù)后內(nèi)膜增生。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)let-7a在靜脈移植模型中的潛在作用,以及l(fā)et-7a抑制VMSC增殖的作用機(jī)制。
  實驗材料與方法
  1、主要試劑
  雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠購買于中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心;CCK-8(Dojindo公司,日本)、pluronicF-127和二甲基亞砜購買于sigma公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白

6、酶買于HyClone公司;下面是各種蛋白的抗體及其購買公司:α-SMA(Proteintech,Chicago,IL,USA),PCNA(Proteintech公司,美國),K-Ras(Proteintech公司,美國)和c-Myc(Bioworld公司,美國),流式細(xì)胞增殖檢測試劑盒購買BD公司。SP法免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色液(福州邁新公司);原位雜交試劑盒(博士德,中國);Real-timePCR試劑盒(TaKaRa公司,日

7、本)。let-7a慢病毒表達(dá)載體及其陰性對照購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限司(病毒滴度1×108)。
  2、動物模型
  10%水合氯醛腹腔麻醉3ml/kg,顯微鏡下(SXP-1B)行無菌顯微外科手術(shù):取小鼠右側(cè)頸總靜脈長約4.5mm,肝素鹽水沖洗后用11-0血管縫合線端-端吻合于腎下腹主動脈,術(shù)后分籠標(biāo)記,由動物實驗中心統(tǒng)一飼養(yǎng)。
  3、基因篩查
  提取組織中的總RNA,運用miRNA基因芯片篩查移植血管模型中

8、差異性表達(dá)的miRNA,并通過real-timePCR進(jìn)一步驗證。
  4、體內(nèi)轉(zhuǎn)染
  以F-127為介質(zhì),將let-7amimics及陰性對照轉(zhuǎn)染進(jìn)入移植血管大鼠體內(nèi)。實驗分為四組:未處理組(untreated組)、凝膠組(Gel組)、陰性對照組(negativecontrols,NC組)、處理組(let-7amimics組)
  5、real-timePCR檢測let-7a的表達(dá)
  Trizol法提取各實

9、驗組細(xì)胞總RNA,異丙醇濃縮RNA,分光光度計測定總RNA的純度。取2μL總RNA,用OneStepPrimeScript(@)miRNAcDNASynthesisKit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。按照SYBRPremixExTaq熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。
  6、組織學(xué)分析
  于術(shù)后28天取組織,福爾馬林固定后包埋,進(jìn)行HE染色和彈力纖維EVG染色,使用光學(xué)顯微鏡觀察內(nèi)膜增生的情況,并且測量內(nèi)

10、膜和中膜的比例。
  7、免疫組化和原位雜交
  石蠟切片行免疫組織化學(xué)檢測α-SMA、PCNA、c-Myc與K-Ras的表達(dá)。原位雜交檢測let-7a的表達(dá)。
  8、細(xì)胞培養(yǎng)
  貼壁法培養(yǎng)原代大鼠VSMCs,細(xì)胞被傳代3-6次。置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中,應(yīng)用含10%血清的高糖DMEM培養(yǎng)。
  9、免疫熒光染色
  細(xì)胞以104密度生長于24孔板或玻片上,加入相應(yīng)的處理措施后,PBS洗滌

11、3次并用多聚甲醛固定,0.1%Triton處理10min。一抗孵育過夜,熒光標(biāo)記二抗室溫孵育2小時,Hoechst33258染核。倒置熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微成像觀察染色情況(Olympus,IX70+DP70)。
  10、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染
  我們應(yīng)用病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)值為1、10、100的let-7amimics感染VSMCs,感染96小時后于熒光顯微鏡(FV1000S-SIM/IX81;Olympus)下觀察GFP熒

12、光標(biāo)記明確let-7a轉(zhuǎn)染效率。
  11、細(xì)胞增殖檢測
  原代VSMCs接種于96孔板,生長至70%,施加相應(yīng)處理措施后加入CCK-8,用ELISA96孔板機(jī)器(BIORAD680,USA)測定450nm處波長,計算出實驗組和對照組細(xì)胞增殖的差異。
  12、細(xì)胞遷移檢測
  取對數(shù)生長期的VSMCs加入24孔板中,轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞,調(diào)整適宜細(xì)胞密度接種于鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室的上室,其下室中加入1

13、0%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8h。4%多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色,使用光學(xué)顯微鏡觀察遷移的細(xì)胞數(shù)。
  13、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期
  胰酶消化細(xì)胞,75%冰乙醇-20℃固定過夜,PBS洗滌一次,100ng/mlRNase及10ng/mlPI37℃染色1小時。流式細(xì)胞儀(FACSCaliber,美國)檢測細(xì)胞周期,并應(yīng)用WinMDI2.9軟件分析細(xì)胞周期分布情況
  14、Western-blot
 

14、 血管組織標(biāo)本或細(xì)胞置于EP管中,加入適量蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑(PMSF),勻漿機(jī)勻漿或超聲破碎細(xì)胞,離心后提取蛋白,考馬斯亮藍(lán)法測蛋白濃度,蛋白上樣量為60μg,體系為20μl。配制10%聚丙烯酰胺凝膠,煮樣后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉(5%脫脂牛奶)、一抗4℃孵育過夜,洗膜45分鐘,加入過氧化物酶標(biāo)記的二抗,37℃孵育2小時后ECL發(fā)光(MF-ChemiBis),并計算光密度值。試驗重復(fù)3次。
  15、統(tǒng)計學(xué)分析
  所有數(shù)

15、據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組內(nèi)數(shù)據(jù)比較采用配對樣本t檢驗或單因素方差分析。所有統(tǒng)計計算由軟件SPSS19.0完成,P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
  實驗結(jié)果
  1、大鼠移植血管中l(wèi)et-7a的表達(dá)下調(diào)
  自體靜脈移植術(shù)后28天,通過微陣列miRNA基因芯片檢測,發(fā)現(xiàn)let-7a的表達(dá)較對側(cè)靜脈明顯降低。通過實時定量PCR驗證發(fā)現(xiàn),移植未處理組在術(shù)后的7天、14天、28天,移植靜脈中l(wèi)et-7a的逐漸降低。術(shù)后28天,處理

16、組let-7a的表達(dá)較對對側(cè)靜脈明顯增高。
  2、let-7a轉(zhuǎn)染位于移植血管的平滑肌細(xì)胞內(nèi)
  免疫組織化學(xué)和原位雜交結(jié)果顯示,let-7a體內(nèi)轉(zhuǎn)染后位于VSMCs內(nèi)。處理組較陰性對照組let-7a表達(dá)多。HE染色結(jié)果顯示,移植術(shù)后28天,處理組的血管內(nèi)膜增生受到抑制。
  3、上調(diào)let-7a能夠抑制移植血管中VSMCs的增殖
  免疫組織化學(xué)檢測PCNA表達(dá),移植術(shù)后4周,處理組PCNA的表達(dá)較陰性對照組

17、低。
  4、血清和血小板源性生長因子能夠抑制let-7a的表達(dá)
  10%血清和20ng/mL的血小板源性生長因子均能抑制VSMCs內(nèi)let-7a的表達(dá)。用不同濃度的PDGF處理VSMCs后48小時,let-7a的表達(dá)隨著PDGF濃度的增加而減少。
  5、上調(diào)let-7a可以抑制VSMCs的遷移和增殖
  通過real-timePCR和熒光顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染慢病毒介導(dǎo)的let-7amimics的最佳感

18、染復(fù)數(shù)(MOI)為100。CCK-8結(jié)果顯示上調(diào)let-7a能夠抑制VSMCs的增殖。Western-blot檢測處理組細(xì)胞內(nèi)PCNA蛋白的表達(dá)較對照組低。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)let-7amimics能夠降低S期VSMCs的數(shù)量。Transwell結(jié)果顯示let-7a能夠降低VSMCs的遷移。
  6、c-Myc和K-Ras是let-7a在VSMCs內(nèi)的2個靶基因
  免疫組織化學(xué)和western-blot結(jié)果顯示體內(nèi)移植靜脈

19、和體外培養(yǎng)VSMCs中處理組c-Myc和K-Ras的表達(dá)較對照組的表達(dá)低。
  結(jié)論
  1、let-7a在移植血管中表達(dá)降低。
  2、let-7a能夠抑制移植血管內(nèi)膜的增生。
  3、let-7a能夠抑制移植血管VSMCs的增殖。
  4、血清和血小板源性生長因子能夠抑制let-7a的表達(dá)。
  5、上調(diào)let-7a可以抑制VSMCs的遷移和增殖。
  6、上調(diào)let-7a可以降低c-Myc

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