Atg7在腦微血管生成和缺血性腦損傷中的作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　血管生成是指在現(xiàn)有的血管基礎(chǔ)上形成新的毛細血管并不斷重塑的過程。正常的腦血管結(jié)構(gòu)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及功能的維持具有重要意義。研究表明，在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均存在腦血管生成異常，而腦血管結(jié)構(gòu)和功能的異常對這些疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療均產(chǎn)生重要影響。因此，探討調(diào)節(jié)腦血管生成的機制就顯得尤為重要。自噬是真核細胞內(nèi)一個依賴于溶酶體的重要的降解途徑，參與調(diào)解內(nèi)皮細胞包括血管生成在內(nèi)的的多種功能。本文則通過體內(nèi)外抑制腦血管內(nèi)皮細

2、胞中自噬相關(guān)基因Atg7的表達來探討自噬在腦血管生成中的作用和調(diào)節(jié)機制。
　　中風(fēng)是世界范圍內(nèi)成人第二大致死和致殘性疾病，可由多種原因引起，其中以缺血性中風(fēng)為最主要的中風(fēng)形式。缺血性中風(fēng)的病理過程非常復(fù)雜，氧氣和葡萄糖的缺乏導(dǎo)致一系列通路的激活。有證據(jù)表明，炎癥和免疫系統(tǒng)參與了急性腦缺血的全部過程，抑制腦內(nèi)炎癥水平會減少中風(fēng)導(dǎo)致的腦梗死體積和神經(jīng)損害，從而有效減少缺血/再灌注帶來的腦損傷。自噬在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中的地位極為重要，但是關(guān)

3、于中風(fēng)后自噬是否具有神經(jīng)元保護作用，大部分的研究都是不確定的或者矛盾的。為了從一個新的角度去理解自噬在腦缺血/再灌注損傷中發(fā)揮的作用，我們采用內(nèi)皮細胞條件性敲除Atg7的小鼠進行實驗，體內(nèi)外模擬中風(fēng)條件，來探討內(nèi)皮細胞自噬對腦缺血/再灌注損傷的影響和調(diào)節(jié)機制。
　　方法:
　　1、選取3個月月齡的血管內(nèi)皮細胞條件性敲除Atg7的雄性純和鼠（Atg7-/-）和同窩Cre陽性的雄性野生鼠(wild type，WT)，經(jīng)心臟灌流取

4、腦，做震蕩切片，免疫熒光染色比較WT鼠與Atg7-/-鼠腦血管生成情況。
　　2、利用matrigel實驗，比較HBMEC對照株(negative control，NC)與Atg7干擾株（Sh-Atg7）在不同時間點的血管生成情況。
　　3、待NC與Sh-Atg7細胞株長到90％密度時，分別用trizol裂解，送mRNA芯片。分析比較二者芯片結(jié)果，尋找與血管生成相關(guān)且表達發(fā)生顯著改變的因子。
　　4、Real-time

5、 PCR檢測比較NC和Sh-Atg7中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的表達情況，以確認芯片結(jié)果。
　　5、ELISA實驗檢測比較NC和Sh-Atg7分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和VEGF的蛋白量。
　　6、選取3個月月齡的WT鼠和Atg7-/-鼠，分別提取鼠腦總mRNA，Real-time PCR檢測比較二者IL-6和VEGF的表達情況。
　　7、利用matrigel實驗，在不同

6、時間點檢測炎癥介質(zhì)IL-6能否補救Sh-Atg7細胞株的血管生成障礙。
　　8、Western blot實驗檢測干擾Atg7后，在生理及應(yīng)激條件下，HBMEC中NF-κB通路p-IKK、p-IKBα及IKBα的表達情況。
　　9、利用核漿分離實驗、免疫熒光染色技術(shù)和凝膠遷移阻滯實驗(EMSA)，檢測p65及HIF-1α的表達、入核及與DNA結(jié)合情況。
　　10、構(gòu)建并篩選高表達Atg7的HBMEC細胞株，Real-ti

7、me PCR檢測Atg7高表達是否影響內(nèi)皮細胞炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄水平。
　　11、Western blot檢測p62降解情況，來確認干擾Atg7是否影響內(nèi)皮細胞的自噬水平。并用自噬的特異性抑制劑3-MA處理正常內(nèi)皮，Real-time PCR檢測相應(yīng)的炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄表達情況。
　　12、做缺血0.5h的小鼠，再灌注24h后，評估小鼠神經(jīng)癥狀，用腦切片模具，切成2mm厚，每個鼠腦5片，然后用2％的TTC染色20min，再換成10％的多

8、聚甲醛浸泡2h，拍照，統(tǒng)計分析鼠腦梗死大小。
　　13、做缺血0.5h再灌注24h小鼠，將鼠前腦的缺血側(cè)第4-8mm trizol裂解，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，Real-time PCR檢測比較Atg7-/-鼠與WT鼠缺血側(cè)腦的炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄表達情況。
　　14、OGD模型:體外以正常的HBMEC為研究對象，先氧糖剝奪5h，再進行正常培養(yǎng)，以模擬缺血/再灌注損傷。分別將再灌注3h、6h、12h和24h的HBMEC用tr

9、izol裂解，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，Real-time PCR檢測不同再灌注時間點的炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄表達情況。其中，0h為沒進行缺血處理的對照組。
　　結(jié)果:
　　1、Atg7-/-鼠腦皮質(zhì)微血管生成減少。
　　2、與對照株相比，Atg7干擾株血管生成能力受到抑制。
　　3、與對照株相比，Atg7干擾株中與血管生成相關(guān)的炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的轉(zhuǎn)錄水平顯著低下。
　　4、R

10、eal-time PCR進一步證實芯片結(jié)果。
　　5、干擾Atg7后，HBMEC分泌的IL-6顯著減少。
　　6、血管內(nèi)皮細胞條件性敲除Atg7后，鼠腦炎癥水平降低。
　　7、IL-6能夠恢復(fù)Sh-Atg7細胞株的血管生成能力。
　　8、干擾Atg7后，HBMEC中NF-κB通路的IKK活化增強，但IKBα表達量增加;在應(yīng)激條件下，NF-κB通路活化良好，但IKBα表達仍然較對照株多。
　　9、干擾Atg7

11、后，p65及HIF-1α入核減少，且p65與NF-κB探針結(jié)合減少，而HIF-1α分布彌散。
　　10、Atg7高表達不影響內(nèi)皮細胞炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄水平。
　　11、干擾Atg7后，內(nèi)皮細胞自噬水平降低。抑制自噬能夠抑制內(nèi)皮細胞炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄。
　　12、敲除Atg7減少鼠腦缺血/再灌注損傷。
　　13、敲除Atg7減少鼠腦缺血/再灌注24h的炎癥水平。
　　14、不能用OGD模型模擬HBMEC缺血/再灌注后的炎