miRNAlet-7c-5p對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　研究腦內(nèi)高表達(dá)的microRNA，let-7c-5p對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，探究其保護(hù)作用的機(jī)制。
　　方法:
　　用線栓法建立小鼠局暫性大腦中動(dòng)脈栓塞模型（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO），通過(guò)側(cè)腦室定位注射（I.C.V）let-7c-5p類似物（mimic）實(shí)現(xiàn)let-7c-5p的過(guò)表達(dá)，研究其對(duì)急性腦缺血再灌注損傷的作用。通過(guò)2,

2、3,5-triphenyltetrazolium chloride（TTC）染色測(cè)定腦梗死體積。為了模擬體內(nèi)缺血再灌注損傷對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響，我們體外培養(yǎng)了原代小膠質(zhì)細(xì)胞和BV-2細(xì)胞，建立體外缺糖缺氧（OGD）再灌注模型，另外，我們還以脂多糖（LPS）和原代皮層神經(jīng)元缺糖缺氧再灌注的上清刺激原代小膠質(zhì)細(xì)胞和BV-2誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Real-time qPCR檢測(cè)急性期中風(fēng)病人血漿、缺血再灌注小鼠血漿、缺血再灌注小鼠皮層梗死半暗區(qū)與造模前

3、后小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)let-7c-5p的表達(dá)；分別采用western blotting、ELISA和Real-time qPCR檢測(cè)由小膠質(zhì)細(xì)胞激活而引起的炎癥介質(zhì)的表達(dá)；通過(guò)免疫組化的方法檢測(cè)缺血再灌注損傷皮層半暗帶小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況。最后采用熒光素酶報(bào)告基因的方法檢測(cè)let-7c-5p的直接靶點(diǎn)。
　　結(jié)果:
　　相對(duì)于健康人，let-7c-5p在中風(fēng)病人血漿中表達(dá)顯著下調(diào)；在缺血再灌注損傷小鼠血漿和皮層梗死半暗區(qū)的表達(dá)也顯

4、著下調(diào)；和陰性對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)let-7c-5p組顯著減少tMCAO模型后梗死體積，并且可以明顯改善缺血引起的神經(jīng)功能缺失。同時(shí)，過(guò)表達(dá)let-7c-5p顯著抑制缺血半暗帶小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，降低半暗帶iNOS、TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果近一步表明，let-7c-5p在不同刺激激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)let-7c-5p可以顯著抑制各種刺激誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞激活所引起的iNOS、COX-2、

5、TNF-α和IL-6的mRNA蛋白的表達(dá)。過(guò)表達(dá)let-7c-5p可以顯著降低caspase3的mRNA和蛋白表達(dá)水平；和共轉(zhuǎn)染caspase3種子序列突變的突變型HEK293細(xì)胞相比，let-7c-5p過(guò)表達(dá)可以顯著降低共轉(zhuǎn)染野生型caspase3 HEK293細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。同時(shí)，過(guò)表達(dá)let-7c-5p可以顯著抑制由LPS誘導(dǎo)的總caspase3和剪切的caspase3的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　過(guò)表達(dá)let-7c-5p