ASIC1a在缺血性腦白質(zhì)損傷中作用的研究.pdf

1、腦白質(zhì)損傷與短時(shí)和長(zhǎng)時(shí)的記憶、記憶力處理速度、執(zhí)行能力降低有關(guān)，并且是輕度認(rèn)知障礙轉(zhuǎn)化為癡呆的危險(xiǎn)因素。腦血管病變和因腦血管病變引起的低灌注是腦白質(zhì)病變的主要原因。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，腦白質(zhì)損傷主要病理表現(xiàn)為髓鞘減少、與髓鞘和軸突損失有關(guān)的組織稀疏、以及輕微的神經(jīng)膠質(zhì)增多。髓鞘主要是由少突膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，對(duì)軸突起到營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)的作用。因此，防止少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷和丟失可以作為治療腦白質(zhì)損傷的一條重要途徑。缺血性腦白質(zhì)損傷相關(guān)機(jī)制仍然不是很清楚。

2、腦缺血后組織由于能量代謝障礙等原因?qū)е滤嵝援a(chǎn)物堆積，引起腦組織酸化，從而激活酸敏感的陽離子通道 ASIC1a。那么，ASIC1a是否參與到缺血性腦白質(zhì)的損傷過程呢？目前有關(guān)的研究甚少。為此，本實(shí)驗(yàn)擬通過大鼠缺血性腦白質(zhì)損傷模型探討ASIC1a在其中的變化、可能的機(jī)制和作用。為臨床治療缺血性腦白質(zhì)病變提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分 ASIC1a在腦白質(zhì)中時(shí)空表達(dá)情況的研究
　　目的：觀察體內(nèi)、體外ASIC1a在腦白質(zhì)的

3、時(shí)空表達(dá)情況。
　　方法：在體內(nèi)通過免疫組化雙標(biāo)的方法檢測(cè)OPC標(biāo)記物NG2、成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CNPase和APC與ASIC1a共標(biāo)情況；在體外同樣通過免疫組化雙標(biāo)的方法檢測(cè)OPC標(biāo)記物A2B5、成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物 CNPase與ASIC1a共標(biāo)情況。
　　結(jié)果：在體內(nèi)胼胝體部位的NG2陽性細(xì)胞、CNPase陽性細(xì)胞、APC陽性細(xì)胞上可見ASIC1a的表達(dá)；在體外，A2B5陽性細(xì)胞、CNPase陽性細(xì)胞與ASIC1

4、a可以雙標(biāo)。
　　結(jié)論：ASIC1a在體內(nèi)、體外腦白質(zhì)中的少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系均有表達(dá)。
　　第二部分 ASIC1a在缺血性腦白質(zhì)損傷中的作用
　　目的：探討ASIC1a在缺血性腦白質(zhì)損傷中的作用。
　　方法：采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎制作缺血性腦白質(zhì)損傷（WML）大鼠模型，腹腔注射不同劑量 ASIC1a通道的抑制劑阿米洛利（2、10mg/kg/d），連續(xù)30 d。隨機(jī)分為正常組（normal）、WML模型對(duì)照組（cont

5、rol）、2mg/kg/d阿米洛利處理組(AMI2)、10mg/kg/d阿米洛利處理組(AMI10)，每組5只。采用Luxol Fast Blue(LFB)染色法檢測(cè)胼胝體髓鞘的形態(tài)；電鏡觀察胼胝體部髓鞘軸突直徑、髓鞘厚度和G-ratio；免疫組織化學(xué)染色觀察APC陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量；Western blot法檢測(cè)MBP、CNPase、caspase-3和ASIC1a的表達(dá)變化；體外酸化環(huán)境誘導(dǎo)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC）損傷，觀察

6、其對(duì)OPC分化的影響。
　　結(jié)果：1）LFB染色顯示，與正常組相比，對(duì)照組胼胝體軸突損傷明顯，髓鞘變稀疏，LFB染色變淺，光密度值顯著降低(P<0.05，vs. normal)；與對(duì)照組比較，AMI2、AMI10組髓鞘變得較密，LFB染色明顯加深，光密度值顯著升高（P<0.05，vs. control）。2）電鏡檢測(cè)胼胝體部位髓鞘軸突直徑、髓鞘厚度和G-ratio。與正常組相比，對(duì)照組髓鞘軸突直徑、髓鞘厚度變短，脫髓鞘現(xiàn)象明顯；與

7、對(duì)照組相比，AMI2、AMI10組髓鞘軸突直徑、髓鞘厚度增加，同時(shí) G-ratio明顯降低。3）免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與正常組相比，胼胝體部位APC陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量減少；與對(duì)照組相比，AMI2、AMI10組APC陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增加。4）Western blot顯示，與正常組相比，在對(duì)照組MBP、CNPase和ASIC1a的表達(dá)顯著降低(P<0.05，vs. normal)；caspase3的表達(dá)增加(P<0.05，

8、vs. normal)。與對(duì)照組相比，AMI2和AMI10組MBP、CNPase和ASIC1a表達(dá)增加(P<0.05，vs.control)；caspase3的表達(dá)下降(P<0.05，vs.control)。5）體外酸化環(huán)境對(duì) OPC分化的影響：pH6.0酸化環(huán)境誘導(dǎo) OPC損傷，OPC分化為CNPase陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，與pH7.0生理?xiàng)l件下相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，vs. pH7.0）。在酸化環(huán)境條件下，阿米洛利抑制

9、組，CNPase陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多，與pH6.0酸環(huán)境相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，vs.pH6.0）。
　　結(jié)論：阿米洛利抑制ASIC1a通道可以改善缺血性腦白質(zhì)損傷，具有髓鞘保護(hù)的作用。
　　第三部分 ASIC1a對(duì)缺血性腦白質(zhì)損傷大鼠認(rèn)知功能的作用
　　目的：探討ASIC1a對(duì)缺血性腦白質(zhì)損傷大鼠認(rèn)知功能影響。
　　方法：采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎制作缺血性腦白質(zhì)損傷（WML）大鼠模型，腹腔注射不同劑

10、量 ASIC1a通道的抑制劑阿米洛利（2、10mg/kg/d），連續(xù)30 d。隨機(jī)分為正常組（normal）、WML模型對(duì)照組（control）、2mg/kg/d阿米洛利處理組(AMI2)、10mg/kg/d阿米洛利處理組(AMI10)，每組5只。通過Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變，記錄各組大鼠的逃避潛伏期的時(shí)間、逃避潛伏期的軌跡。
　　結(jié)果：在4天的定位航行訓(xùn)練中，與正常組的逃避潛伏期時(shí)間（10.74±1.

11、469s）相比，對(duì)照組逃避潛伏期時(shí)間（29.13±3.535s）明顯延長(zhǎng)（p<0.05，vs. normal）；與對(duì)照組相比，AMI2逃避潛伏期時(shí)間（22.16±1.978s），有差異但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05，vs. control），AMI10處理組逃避潛伏期時(shí)間（18.79±1.195s）明顯縮短，其中以最后一天結(jié)果最顯著，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05，vs. control）。
　　結(jié)論：阿米洛利通過抑制ASIC1a