DLL4-Notch信號途徑在胃癌新生血管生成中的作用及其機(jī)制.pdf

1、目的：胃癌是常見的惡性腫瘤，與其他實(shí)體腫瘤相似，新生血管生成在胃癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。Delta-like ligand4(DLL4)作為Notch信號途徑中的一個重要配體，參與復(fù)雜的信號傳導(dǎo)通路，通過相鄰細(xì)胞之間通訊調(diào)控細(xì)胞發(fā)育。近年研究發(fā)現(xiàn)：DLIA在人類多種腫瘤血管組織中過表達(dá)，并與腫瘤分子生物學(xué)特性密切相關(guān)，但DLL4/Notch信號途徑在腫瘤新生血管生成中的作用及機(jī)制尚缺乏了解。本課題以胃癌為例，初步探討DLL

2、4/Notch信號途徑在胃癌新生血管生成中的作用及其機(jī)制，期望為胃癌抗血管生成提供新的靶點(diǎn)與理論依據(jù)。
　　 方法：(1)收集92例外科手術(shù)切除胃癌標(biāo)本及距病灶約5cm的癌旁正常胃粘膜組織制作組織芯片，采用免疫組化技術(shù)檢測DLL4的表達(dá)，分析其與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系；(2)構(gòu)建一個表達(dá)DLL4小干擾RNA的重組腺相關(guān)病毒載體，制備靶向性抑制DLL4表達(dá)的高滴度重組腺相關(guān)病毒(rAAV2-U6-DLLA-shRNA-EGFP)；

3、(3)將rAAV2-U6-DLL4-shRNA-EGFP感染HUVECs細(xì)胞，半定量RT-PCR，Western blot分別檢測HUVECs細(xì)胞DLL4-mRNA和DLL4蛋白的改變；流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞周期分布，MTT比色法檢測細(xì)胞的生長變化，采用Matrigel三維培養(yǎng)系統(tǒng)觀測HUVECs體外血管形成能力的變化；(4)建立胃癌細(xì)胞的荷瘤裸鼠模型，將rAAV-DLL4-shRNA予以荷瘤組織局部注射，觀察腫瘤生長情況；應(yīng)用免疫組化法

4、觀察腫瘤微血管數(shù)量、腫瘤微血管形態(tài)及腫瘤組織中Ephrin B2、DLL4蛋白表達(dá)的改變。
　　 結(jié)果：(1)DLL4在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常胃粘膜(85.9％vs35.3％，P<0.01)。DLL4表達(dá)與胃癌的轉(zhuǎn)移(r=0.612，P<0.01)和胃壁浸潤深度(r=0.482，P<0.01)呈正相關(guān)。DLIA表達(dá)陽性組的MVD指數(shù)明顯高于DLL4表達(dá)陰性組(70.5±16.2 vs32.5±10.4)，DLLA表達(dá)與

5、MVD呈正相關(guān)(r=0.521，P<0.01)(2)PCR和測序證實(shí)，成功構(gòu)建包含U6啟動子和DLL4特異性RNA干擾片段的重組腺相關(guān)病毒載體pSNAV2.0-shRNA-DLL4，并制備出滴度為2.4×1011vectorgenome/L的高滴度腺相關(guān)病毒rAAV2-U6-DLL4-shRNA-EGFP；(3)重組腺相關(guān)病毒載體能明顯抑制HUVECs細(xì)胞DLIA-mRNA和DLIA蛋白的表達(dá)(P<0.05)，促進(jìn)HUVECs細(xì)胞株的生

6、長增殖，細(xì)胞周期中G0/G1比例降低，S期比例明顯上升，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖指數(shù)為39.90±2.19％，對照組細(xì)胞的增殖指數(shù)為25.74±4.54％.P<0.05。HUVECs在Matrigel形成小管樣結(jié)構(gòu)能力增強(qiáng)，TLS長度均明顯增加(P<0.05)；(4)rAAV2-U6-DLL4-shRNA-EGFP重組腺相關(guān)病毒能有效抑制荷瘤裸鼠腫瘤生長，腫塊的體積和重量明顯小于對照組(P<0.05)，腫瘤組織中微血管密度明顯高于對照組，但腫瘤微

7、血管形態(tài)以不成熟的點(diǎn)狀型和線狀型為主。腫瘤組織中的DLL4、Ephrin B2蛋白表達(dá)下降，與MVD者成負(fù)相關(guān)(r=-0.510，P<0.05； r=-0.410，P<0.05)。
　　 結(jié)論：①DLIA與胃癌組織新生血管生成及病理生物學(xué)行為關(guān)系密切，其表達(dá)水平可作為判斷胃癌侵襲轉(zhuǎn)移情況及患者預(yù)后的參考指標(biāo)之一。②特異性阻斷DLL4/Notch信號途徑能有效促進(jìn)HUVECs細(xì)胞增殖，增強(qiáng)HUVECs在Matrigel形成小管樣結(jié)