Notch信號途徑對小細胞肺癌的調(diào)控作用及其機制研究.pdf

1、肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrine tumor,NET)由具有多向分化潛能的腫瘤干細胞形成,與普通型肺癌相比,其不僅在組織形態(tài)上具有明顯的異質(zhì)性,而且在腫瘤生物學(xué)行為以及對藥物治療的反應(yīng)性上也存在著顯著差異。肺NET可以生成多種神經(jīng)內(nèi)分泌(NE)標(biāo)志物和活性激素,主要包括:嗜鉻素蛋白A(CgA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、抗利尿激素(ADH)等,這些異位激素的產(chǎn)生,可引起內(nèi)分泌、神經(jīng)、消化、

2、造血、腎臟、骨關(guān)節(jié)及皮膚等系統(tǒng)和器官發(fā)生病變,并出現(xiàn)相應(yīng)的臨床表現(xiàn),在臨床上統(tǒng)稱為“副腫瘤綜合癥”。小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)屬于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的一種。關(guān)于它的起源,目前存在著兩種觀點:一種認為它起源于支氣管粘膜上皮內(nèi)Kulchitsky細胞,而另一種則認為它是由支氣管粘膜干細胞分化而來。在肺癌中,小細胞肺癌的發(fā)生率較高,僅低于肺鱗癌及腺癌,其發(fā)生率約占原發(fā)性肺癌的20％-25%。本癌的惡性度極

3、高,生長迅速,多數(shù)存活期不超過一年,因多有早期轉(zhuǎn)移,一般不適合手術(shù)切除,目前小細胞肺癌的治療及預(yù)后尚無突破性進展。Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切,在許多腫瘤細胞系中檢測到Notch基因表達的異常,且紊亂的Notch途徑在維持腫瘤表型方面起著重要作用。Notch基因編碼一種300 kD的跨膜蛋白受體,受體的細胞內(nèi)區(qū)是Notch的活化形式,當(dāng)受體與配體結(jié)合時,Notch受體經(jīng)γ一分泌酶水解剪切并釋放其胞內(nèi)段的活性部分(

4、NIC),隨后,NIC轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi),與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控下游基因表達。在哺乳動物中NIC的直接靶蛋白包括CBF-1,當(dāng)CBF-1與NIC結(jié)合后,通過蛋白的構(gòu)象改變使原先被抑制的位于CBF-1結(jié)合序列下游的基因開放表達。Notch途徑的下游基因包括HES基因家族和細胞周期相關(guān)蛋白基因。HES基因家族編碼一類含有特征性α螺旋-環(huán)-螺旋(αHLH)結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合蛋白,它可結(jié)合在hASH1基因的啟動子上,從而抑制該基因的轉(zhuǎn)錄。迄今,有關(guān)肺癌神

5、經(jīng)內(nèi)分泌分化的調(diào)節(jié)以及維持的分子機制尚不十分清楚,但有研究表明,hASH1基因的表達與肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的分化表型和分化程度密切相關(guān)。因此Notch信號途徑就可以通過靶基因HES對分化效應(yīng)基因hASH1的抑制,來間接地對肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤進行調(diào)控。目前,已經(jīng)有人對Notch信號途徑在小細胞肺癌中的調(diào)控進行了研究,但研究的內(nèi)容還局限于分子調(diào)控機制和形態(tài)學(xué)等方面,如Notch1可引起小細胞肺癌細胞中hASH1表達的顯著降低,Notch信號途徑可

6、以抑制小細胞肺癌的生長和增殖等。在胰腺癌當(dāng)中,Notch信號途徑可以抑制神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細胞標(biāo)志物的生成,但在肺的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中還未曾有過這方面的報道。因此我們考慮采用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法,在小細胞肺癌細胞株中表達組成性活化的Notch1,來研究Notch信號途徑對小細胞肺癌的調(diào)控作用,特別是轉(zhuǎn)染前后癌細胞神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物表達的變化,通過以上研究,為目前缺乏有效治療手段的小細胞肺癌患者提供治療的新思路。材料和方法本實驗采用的小細胞肺癌細胞

7、株為NCI-H446。重組質(zhì)粒PEFBOS-NIC-MYC由第四軍醫(yī)大學(xué)遺傳與發(fā)育生物學(xué)教研室惠贈。首先我們把獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到感受態(tài)大腸桿菌中,進行了質(zhì)粒抽提并送到公司測序,測序結(jié)果出來后我們對重組質(zhì)粒進行了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,同時設(shè)定兩個對照組(即轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組BOS-446和未轉(zhuǎn)染組control-446),待藥物篩選獲得穩(wěn)定細胞株后,進行擴大培養(yǎng),最后通過RT-PCR方法對各組細胞的Notch1、HES1及hASH1基因表達進行檢測,通過M

8、TT實驗對三組細胞的增殖活力進行了對比分析,應(yīng)用免疫細胞化學(xué)標(biāo)記和Western blot技術(shù)對轉(zhuǎn)染前后NE細胞標(biāo)志物(CgA、NSE)的變化進行了檢測。結(jié)果1.RT-PCR檢測目的基因和下游基因的表達:在兩個對照組中(control-446和BOS-446)并沒有發(fā)現(xiàn)Notch1、HES1基因的表達,而在轉(zhuǎn)染組中(NIC-446)發(fā)現(xiàn)了Notch1、HES1基因的表達。在兩個對照組中有hASH1的表達,而在轉(zhuǎn)染組中hASH1的表達明顯

9、降低。2.細胞活力分析:我們對三組細胞的細胞增殖情況進行了對比分析,各組細胞以2X10～3/孔接種至96孔板(3復(fù)孔),連續(xù)六天用MTT法測定細胞增殖活力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組的細胞活力明顯降低,與對照組(control-446和BOS-446)之間有顯著差異(P=0.037和0.043,t檢驗)。3.免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果:三組細胞爬片后進行了免疫細胞化學(xué)標(biāo)記,爬片應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進行灰度分析,與對照組相比,轉(zhuǎn)染組的這兩種神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物的表

10、達量顯著降低,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001,t檢驗)。4.Western blot檢測目的蛋白和神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物的表達:在轉(zhuǎn)染組中存在NIC-MYC融合蛋白的表達,在對照組中未見目的蛋白的表達。在兩個對照組細胞中,NE標(biāo)志物CgA、NSE具有明顯的表達,表現(xiàn)為條帶較亮,而在轉(zhuǎn)染組中,兩個蛋白的表達量顯著降低,表現(xiàn)為條帶較暗。用凝膠成像分析系統(tǒng)Quantityone對條帶密度進行半定量分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組細胞神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物的表達