調(diào)控mTOR信號(hào)通路對(duì)癲癇的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、mTOR(mammalian target of rapamycn)信號(hào)通路是一條調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等的信號(hào)通路。以往研究表明，mTOR信號(hào)通路參與了紅藻氨酸(KA)誘導(dǎo)的大鼠癲癇的發(fā)生，并導(dǎo)致一系列癲癇后病理變化。雷帕霉素（Rapamycin）是mTOR信號(hào)通路特異性抑制劑，能夠抑制mTOR信號(hào)通路的異常激活，并改善癲癇后病理變化以及減少自發(fā)性癲癇的產(chǎn)生，從而發(fā)揮潛在的抗癲癇作用。
　　因此，在研究中探討了雷帕霉素給

2、藥在正常SD大鼠以及KA誘發(fā)癲癇模型大鼠中對(duì)mTOR信號(hào)通路的作用。同時(shí)，構(gòu)建條件性敲除神經(jīng)前體細(xì)胞Rptor基因的小鼠，探討敲除雷帕霉素作用靶點(diǎn)Raptor蛋白后對(duì)癲癇及并發(fā)癥的影響，以明確mTOR信號(hào)通路在癲癇調(diào)控中的作用。
　　第一章雷帕霉素對(duì)mTOR信號(hào)通路的矛盾性作用
　　目的:前期研究發(fā)現(xiàn)，在KA誘導(dǎo)癲癇模型中提前較短時(shí)間給予雷帕霉素，更嚴(yán)重地激活以S6蛋白磷酸化為檢測(cè)指標(biāo)的mTOR信號(hào)通路，這與雷帕霉素對(duì)mTO

3、R信號(hào)通路的抑制性作用相矛盾。因此，本研究擬在正常SD大鼠及KA誘導(dǎo)的SD大鼠癲癇模型中對(duì)雷帕霉素的矛盾性作用進(jìn)行更詳細(xì)的研究，明確雷帕霉素對(duì)mTOR信號(hào)通路及癲癇的作用。
　　方法:在正常SD大鼠中給予單次不同劑量(0.3，1，3，10mg/kg)的雷帕霉素以及給予單次單一劑量雷帕霉素(3mg/kg)作用不同時(shí)間點(diǎn)(1，3，6，15，24h)，以確定雷帕霉素的量效與時(shí)效關(guān)系。同時(shí)，在KA誘導(dǎo)急性癲癇發(fā)作前，不同時(shí)間(1，3，6，

4、15，24h)給予雷帕霉素以及雷帕霉素給藥后急性癲癇發(fā)作不同時(shí)間(1，3，6，15，24h)，檢測(cè)S6蛋白磷酸化，以探討雷帕霉素對(duì)癲癇mTOR信號(hào)通路的作用。另外，監(jiān)測(cè)雷帕霉素不同時(shí)間(1，10h)給藥后癲癇癥狀以及癲癇后神經(jīng)細(xì)胞死亡，探討雷帕霉素矛盾性作用的影響。最后，檢測(cè)mTOR信號(hào)通路中Akt，Raptor，Rictor，S6k，S6蛋白磷酸化，以及給予Akt抑制劑哌立福辛(Perifosine)，探討雷帕霉素矛盾性作用的可能機(jī)制

5、。
　　結(jié)果:
　　1.在正常SD大鼠中，提前3-24小時(shí)給予雷帕霉素能夠抑制S6蛋白磷酸化，并呈劑量依賴(lài)性，而提前1小時(shí)給予雷帕霉素反而矛盾性增加了S6蛋白磷酸。
　　2.在KA誘導(dǎo)的急性癲癇模型中，提前10小時(shí)給予雷帕霉素，能夠抑制癲癇導(dǎo)致mTOR信號(hào)通路的激活，而提前1-6小時(shí)給予雷帕霉素，反而矛盾性加重了癲癇導(dǎo)致mTOR信號(hào)通路的激活。
　　3.提前1小時(shí)給予雷帕霉素，加重了癲癇的嚴(yán)重程度、癲癇持續(xù)時(shí)間及

6、神經(jīng)細(xì)胞死亡，而提前10小時(shí)給予雷帕霉素，對(duì)癲癇癥狀沒(méi)有影響，但是可以減少神經(jīng)元死亡。
　　4.雷帕霉素對(duì)S6蛋白磷酸化的矛盾性作用與上游mTOR信號(hào)通路相關(guān)，并且，提前給予Akt抑制劑哌立福辛能夠逆轉(zhuǎn)雷帕霉素對(duì)S6磷酸化的矛盾性作用。
　　結(jié)論:短時(shí)間給予雷帕霉素誘導(dǎo)了S6蛋白激活，廢除了雷帕霉素的抗癲癇作用。雷帕霉素對(duì)mTOR通路的調(diào)節(jié)具有高度復(fù)雜性，其原因可能與上游信號(hào)通路相關(guān)。
　　第二章選擇性敲除神經(jīng)前體細(xì)胞

7、中Rptor基因敲除對(duì)mTOR信號(hào)通路的作用
　　目的:Raptor蛋白是mTOR信號(hào)通路中mTOR激酶調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白，由Rptor基因編碼。前期研究提示mTOR信號(hào)通路在癲癇發(fā)生中具有重要作用。為了探討Raptor蛋白在癲癇及癲癇導(dǎo)致的相關(guān)疾病中的作用，制備在神經(jīng)前體細(xì)胞中敲除Rptor的條件性敲除小鼠，以明確Raptor蛋白的作用。
　　方法:構(gòu)建條件性敲除神經(jīng)前體細(xì)胞Rptor基因小鼠，對(duì)基因敲除小鼠外觀及發(fā)育進(jìn)行觀察。

8、同時(shí)，觀察在正常情況及紅藻氨酸(KA)致病后，基因敲除小鼠mTOR信號(hào)通路的改變及癲癇狀態(tài)。FJB染色和TIMM染色分別觀察KA致癇后基因敲除小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞死亡情況和苔蘚纖維發(fā)芽情況，并EEG記錄致癇后基因敲除小鼠自發(fā)性癲癇頻率。最后，水迷宮實(shí)驗(yàn)，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和興奮性實(shí)驗(yàn)觀察小鼠行為學(xué)變化。
　　結(jié)果:
　　1.Rptor基因敲除小鼠（Rptor CKO mice）在外觀與對(duì)照小鼠沒(méi)有區(qū)別，并且Rptor基因敲除后，mTORC1

9、信號(hào)通路被抑制。
　　2.Rptor基因敲除小鼠腦重及體重比對(duì)照小鼠低，并且大腦上皮層神經(jīng)元厚度減少。
　　3.KA誘導(dǎo)癲癇后，KA導(dǎo)致的mTOR信號(hào)通路過(guò)度激活得到抑制，但Rptor基因敲除小鼠癲癇狀態(tài)與對(duì)照小鼠沒(méi)有明顯差異。
　　4.在Rptor基因敲除小鼠中，存在極少次數(shù)的自發(fā)性癲癇，且癲癇導(dǎo)致的苔蘚纖維發(fā)芽得到改善。
　　5.Rptor基因敲除小鼠在一定程度能夠減少KA導(dǎo)致的認(rèn)知障礙，減少焦慮行為及過(guò)度興