mTOR信號(hào)通路在慢性痛形成和維持中的作用及機(jī)制.pdf

1、研究背景:哺乳動(dòng)物的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它存在于哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)。mTOR可形成兩種功能不同的蛋白質(zhì)復(fù)合物。當(dāng)它結(jié)合到Raptor蛋白，便形成mTOR的復(fù)合物1，它對(duì)雷帕霉素敏感，并控制蛋白質(zhì)的翻譯，參與形成持續(xù)性疼痛及其引起的疼痛敏感。
　　慢性痛持續(xù)性疼痛是一個(gè)重大的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題。它的特點(diǎn)是疼痛過(guò)敏，包括自發(fā)的持續(xù)或間歇性燒灼樣疼痛，對(duì)疼痛刺激通常無(wú)害的刺激反應(yīng)過(guò)強(qiáng)。其生物化學(xué)機(jī)制包

2、括初級(jí)傳入神經(jīng)元的背根神經(jīng)節(jié)（DRG）和中樞神經(jīng)系統(tǒng)接受傷害刺激的突觸上受體、酶和離子電壓依賴通道的表達(dá)和功能的變化。mTOR的翻譯和表達(dá)，在持續(xù)性疼痛的疼痛敏感機(jī)制中具有重要的作用。
　　有文獻(xiàn)報(bào)道，生長(zhǎng)因子可通過(guò) PI3K、AKT來(lái)調(diào)控 mTOR，在大鼠皮膚的有髓感覺(jué)纖維亞群上發(fā)現(xiàn)了磷酸化的mTOR和它下游的一些翻譯元件（p-70S6K和p-4E-BP1）。用肌電圖證實(shí)應(yīng)用mTOR抑制劑，可以降低損傷后機(jī)械痛敏相關(guān)的一些有髓傷

3、害感受的敏感性；行為學(xué)結(jié)果表明，局部注射mTOR抑制劑雷帕霉素可以顯著降低組織損傷引起的持續(xù)疼痛。同樣，局部應(yīng)用mTOR抑制劑可以降低損傷點(diǎn)周圍的機(jī)械痛敏，降低外周神經(jīng)損傷引起的長(zhǎng)時(shí)機(jī)械痛敏?？梢?jiàn)，mTOR通過(guò)調(diào)節(jié)局部蛋白質(zhì)的合成而完成對(duì)外周傳入纖維的傷害性敏感性的調(diào)節(jié)。由于外周感覺(jué)傳入神經(jīng)元屬假單極神經(jīng)元，以及軸突雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的存在，推測(cè)在脊髓可能同樣存在mTOR依賴的局部蛋白質(zhì)合成。但對(duì)于非疼痛狀態(tài)下mTOR信號(hào)通路及其下游因子在脊髓和

4、DRG的表達(dá)分布和細(xì)胞定位未見(jiàn)有報(bào)道。
　　研究發(fā)現(xiàn)，mTOR在神經(jīng)系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)非神經(jīng)細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)育，調(diào)節(jié)突觸的可塑性。在神經(jīng)系統(tǒng)的某些疾病如帕金森病、阿爾茨海默病都常合并有mTOR通路的異常。mTOR被神經(jīng)遞質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)因子、激素、缺血等多種物質(zhì)激活后，通過(guò)其下游的效應(yīng)器調(diào)節(jié)蛋白的翻譯，并通過(guò)下游多種途徑對(duì)靶蛋白進(jìn)行磷酸化而發(fā)揮抗凋亡作用。而雷帕霉素是其特異性抑制劑。對(duì)于鞘內(nèi)給予雷帕霉素對(duì)CCI大鼠痛閾以及對(duì)mTOR信

5、號(hào)通路的影響未見(jiàn)有報(bào)道。
　　近來(lái)的研究表明，mTOR和它下游的效應(yīng)器也許會(huì)涉及神經(jīng)性疼痛、炎癥疼痛和癌痛。系統(tǒng)和局部注射雷帕霉素，一種選擇性的mTOR抑制劑，已經(jīng)證明能減緩機(jī)械刺激的超敏反應(yīng)，無(wú)論超敏反應(yīng)是由足底注射卡拉膠或辣椒素（炎癥疼痛）、外周神經(jīng)損傷（神經(jīng)性疼痛）所誘導(dǎo)，還是由注射前列腺癌細(xì)胞進(jìn)脛骨（骨癌疼痛）所誘導(dǎo)。雖然mTOR和S6K1在小的DRG神經(jīng)元和脊髓后角神經(jīng)元高度表達(dá)，但是在通常條件下，他們的激活（磷酸化）產(chǎn)

6、物僅是低水平的表達(dá)。已有研究表明，足底注射卡拉膠或骨癌引起的損傷會(huì)導(dǎo)致大鼠脊髓后角p-mTOR和p-S6K1的增加，但是在DRG沒(méi)有。然而，對(duì)mTOR在慢性炎癥疼痛的所起的作用卻知之甚少。而且，在脊髓和DRG的外周神經(jīng)損傷后，是否mTOR和它的下游效應(yīng)器會(huì)被激活還存在爭(zhēng)議。
　　神經(jīng)性疼痛慢性疼痛的生物學(xué)機(jī)制目前尚未完全明了，控制與治療也并不完善。新開發(fā)的以受體靶標(biāo)作用于周邊C-感受器以降低神經(jīng)性疼痛的藥物已經(jīng)證明作用甚微，靶向于

7、A-傷害性感受器可用于治療慢性疼痛。事實(shí)上，A-纖維敏感背角神經(jīng)元的信號(hào)放大可能與神經(jīng)病理性疼痛的二次痛覺(jué)過(guò)敏（損傷部位周圍對(duì)傷害性刺激敏感性增加）和異常性疼痛（疼痛由于一個(gè)正常無(wú)害刺激）的兩個(gè)臨床特征有關(guān)。調(diào)節(jié) A-疼痛感受器作用于 mTOR信號(hào)通路有助于提高外周損傷后疼痛的感覺(jué)靈敏度。研究顯示，局部皮膚給予雷帕霉素，阻斷激活的mTOR下游目標(biāo)，緩解了局部炎癥或神經(jīng)性疼痛相關(guān)的機(jī)械性超敏反應(yīng)。因此，作用于 mTOR信號(hào)通路可作為傷害感

8、受器靈敏度的調(diào)節(jié)。如果靶向的mTOR信號(hào)通路具有潛在的治療作用用于控制神經(jīng)性疼痛慢性疼痛，而全身性用藥的作用則尚不清楚。
　　針對(duì)mTOR信號(hào)通路在慢性疼痛中發(fā)揮的特殊作用，結(jié)合現(xiàn)有的臨床應(yīng)用的相關(guān)藥物產(chǎn)生的抑制或影響通路傳導(dǎo)的作用，在動(dòng)物模型上獲得減弱或消除慢性疼痛相關(guān)癥狀的效果。對(duì)mTOR信號(hào)通路的進(jìn)一步深入研究，將有助于研發(fā)效力更強(qiáng)、副作用更小的新型靶向治療慢性疼痛的藥物。
　　本研究觀察非疼痛狀態(tài)下mTOR及其下游因

9、子真核細(xì)胞起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）、p70核糖體S6蛋白激酶（p70S6K），以及其磷酸化形態(tài)在脊髓背角和背根神經(jīng)節(jié)（DRG）和的表達(dá)和分布，以及細(xì)胞定位。觀察經(jīng)不同途徑（鞘內(nèi)給藥、局部給藥、全身性給藥）抑制mTOR信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)性痛、炎性痛等不同疼痛模型誘導(dǎo)慢性痛的形成和維持以及對(duì)機(jī)械和冷痛熱痛超敏反應(yīng)的影響，探討mTOR信號(hào)通路在慢性痛中的作用及其機(jī)制。
　　研究目的:觀察mTOR及其下游因子真核細(xì)胞起始因子4E

10、結(jié)合蛋白1/2（4E-BP1/2）、p70核糖體S6蛋白激酶（p70S6K），以及其磷酸化形態(tài)在脊髓背角和背根神經(jīng)節(jié)（DRG）和的表達(dá)和分布。觀察經(jīng)不同途徑（鞘內(nèi)給藥、局部給藥、全身性給藥）抑制mTOR信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)性痛、炎性痛等不同疼痛模型誘導(dǎo)慢性痛的形成和維持以及對(duì)機(jī)械和冷熱痛超敏反應(yīng)的影響，評(píng)價(jià)mTOR信號(hào)通路在慢性痛中的作用及其機(jī)制。
　　研究方法:
　?。?）以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)、Western blot確定非疼

11、痛狀態(tài)下mTOR及其下游因子4E-BP1/2和p70S6K及其磷酸化形式在背根神經(jīng)節(jié)和背角的表達(dá)。免疫組化染色確定mTOR、4E-BP1和p70S6K及其磷酸化形式在背根神經(jīng)節(jié)和背角的定位，并定量分析。
　?。?）經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)、免疫組化染色、免疫印跡方法分析鞘內(nèi)給予 mTOR信號(hào)通路抑制劑雷帕霉素對(duì)CCI術(shù)后大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾以及脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞的影響。
　　（3）經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)、免疫組化染色、免疫印跡方法分析完全弗氏佐劑(

12、complete Freund's adjuvant，CFA)足底注射導(dǎo)致的慢性炎癥疼痛過(guò)程中和在脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)導(dǎo)致的神經(jīng)性疼痛過(guò)程中，mTOR和S6K1在大鼠的DRG和脊髓的表達(dá)和激活。
　?。?）經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)、免疫組化染色、免疫印跡方法分析西羅莫司脂化（CCI-779）足底局部和全身性給藥對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的影響，以及觀察Torin1全身性給藥對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的影響。
　　結(jié)果:
　?。?）mTOR、4E-BP

13、1和p70S6K分布在整個(gè)脊髓背角和DRG，特別是在脊髓背角的外層，而磷酸化形式在脊髓背角和DRG表達(dá)都非常低，沒(méi)有檢測(cè)到。在脊髓背角，mTOR、p70S6K和4E-BP1表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞，在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞沒(méi)有表達(dá)。在DRG，mTOR和p70S6K表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞，26.1％（±3.2％）呈mTOR表達(dá)陽(yáng)性，19.1％（±1.9％）呈p70S6K表達(dá)陽(yáng)性；4E-BP1則表達(dá)于衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞。
　?。?）與對(duì)照組相比，CCI

14、組機(jī)械痛閾和熱痛閾從CCI第4天開始下降；前后給藥對(duì)照劑組與CCI組相比無(wú)明顯差異。與CCI組相比，前給藥組痛閾從CCI第4天開始上升，直到第14天都有明顯差異。與CCI組相比，后給藥組痛閾從CCI第8天開始上升，直到第14天都有明顯差異。與正常組比較，CCI組、前、后對(duì)照劑組損傷側(cè)脊髓背角GFAP陽(yáng)性面積與陽(yáng)性區(qū)平均光密度均有明增加。與CCI組比較，前、后給藥組損傷側(cè)GFAP陽(yáng)性面積與陽(yáng)性區(qū)平均光密度均有明顯降低。
　　（3）C

15、FA注射產(chǎn)生機(jī)械刺激的超敏反應(yīng)，縮爪閾P(yáng)WT減少；熱疼痛的超敏反應(yīng)，縮爪潛伏期 PWL減少?；紓?cè)超敏反應(yīng)在CFA注射后的2h出現(xiàn)，約1天后達(dá)高峰值，并且持續(xù)7天。mTOR和S6K1的激活水平隨著時(shí)間的推移而顯著增加。和對(duì)照組相比，CFA注射后2h，p-mTOR和p-S6K1顯著增加(p-mTOR：2.58±0.52倍于對(duì)照組；p-S6K1：2.49±0.03倍于對(duì)照組；P<0.05)，并且持續(xù)至少7天。鞘內(nèi)注射雷帕霉素大鼠的同側(cè)的PWT

16、增加了5.25倍，相比于空白對(duì)照的大鼠，P<0.01；PWL(3.59±0.26 s)顯著減少，相比于基礎(chǔ)的PWL(10.28±0.60s)，P<0.01。鞘內(nèi)注射雷帕霉素大鼠的同側(cè)的PWL增加了1.6倍，P<0.05。
　?。?）在皮膚和背根神經(jīng)節(jié)的有髓初級(jí)傳入神經(jīng)纖維有磷酸化 mTOR（p-mTOR）表達(dá)，mTOR和其磷酸化（P-mTOR）形式與傳入感覺(jué)神經(jīng)的標(biāo)志物PGB共染，并且表達(dá)于周圍皮膚組織的非神經(jīng)元細(xì)胞，表明其廣泛表

17、達(dá)于初級(jí)傳入感覺(jué)神經(jīng)纖維亞群。P-mTOR連續(xù)表達(dá)于軸突，真皮層內(nèi)P-mTOR陽(yáng)性軸突可達(dá)數(shù)百微米。足底注射CCI-779降低神經(jīng)病理性痛模型的機(jī)械痛和冷痛閾，全身性給予CCI-779降低神經(jīng)性疼痛和炎癥性疼痛小鼠對(duì)機(jī)械和冷刺激的反應(yīng)。
　　結(jié)論:
　?。?）在非疼痛狀態(tài)下，mTOR及其下游因子p70S6K和4E-BP1/2在脊髓背角和DRG表達(dá)豐富，而它們的磷酸化活化形式表達(dá)非常低。
　?。?）鞘內(nèi)給予雷帕霉素抑制m

18、TOR信號(hào)通路可以降低神經(jīng)病理性痛模型CCI大鼠的機(jī)械痛和熱痛超敏反應(yīng)，并抑制脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞的激活。
　?。?）在大鼠足底注射CFA誘導(dǎo)的外周炎癥激活了mTOR信號(hào)通路，mTOR及其下游因子磷酸化在脊髓和DRG的表達(dá)增加，鞘內(nèi)注射雷帕霉素可以抑制CFA誘導(dǎo)的疼痛超敏反應(yīng)。
　?。?）足底注射CCI-779降低神經(jīng)病理性痛模型的機(jī)械痛和冷痛閾，全身性給予CCI-779或Torin1可以抑制脊髓和DRG的mTOR信號(hào)通路活化，