葛根素通過AMPK-mTOR信號(hào)通路調(diào)控自噬發(fā)揮對(duì)心肌肥厚的保護(hù)作用.pdf

1、心肌肥厚是心臟應(yīng)對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌激活以及壓力超負(fù)荷的適應(yīng)性代償反應(yīng)。在早期階段，心肌主要通過肌節(jié)數(shù)目的增多以及體積的增大平衡增大的室壁張力，進(jìn)而維持心泵輸出的穩(wěn)定以及滿足機(jī)體生長發(fā)育及代謝的需要。如果刺激因素的持續(xù)存在，必將發(fā)生包括心肌細(xì)胞肥大、心肌細(xì)胞丟失、間質(zhì)纖維化等在內(nèi)的惡性心肌重構(gòu)。神經(jīng)內(nèi)分泌-細(xì)胞因子系統(tǒng)的激活，與心室重構(gòu)互為因果，形成惡性循環(huán)，逐漸進(jìn)展為失代償性的心肌收縮功能障礙，即心力衰竭。因此，深入探討心肌肥厚相關(guān)分子學(xué)機(jī)制

2、，尋找潛在靶點(diǎn)有效干預(yù)以及延緩心肌肥厚發(fā)生發(fā)展對(duì)減少心力衰竭發(fā)生以及改善預(yù)后意義重大。
　　自噬，是細(xì)胞在應(yīng)激情況下所做出的一種非損傷性應(yīng)答反應(yīng)，其通過對(duì)自身胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)和（或）細(xì)胞器進(jìn)行包裹吞噬形成自噬體，進(jìn)一步與溶酶體發(fā)生融合形成自噬溶酶體，最終將吞噬物降解。通過自噬，降解產(chǎn)物供給細(xì)胞重新利用或排出細(xì)胞外，因此對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能以及代謝平衡的維持具有重要意義。
　　葛根素是一種從豆科植物野葛根中提取的黃酮類單體，其化學(xué)名稱為

3、4'，7-二羥基-8-β-D-葡萄糖異黃酮。眾多國內(nèi)外研究表明，葛根素藥效廣泛，可應(yīng)用于腫瘤、糖尿病、神經(jīng)退行性變以及炎癥等多種臨床疾病的治療。在心血管系統(tǒng)中，葛根素具有抑制離子通道、抗血小板活化、抗細(xì)胞凋亡以及擴(kuò)張血管等生物學(xué)功能。本研究分別通過腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)構(gòu)建壓力超負(fù)荷大鼠模型以及異丙腎上腺素刺激H9C2細(xì)胞肥大，觀察自噬的時(shí)序性變化特征。通過葛根素治療心肌肥大模型，觀察自噬以及心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化。通過對(duì)自噬相關(guān)蛋白的基因表

4、達(dá)進(jìn)行特異性干擾，觀察對(duì)葛根素心肌保護(hù)作用的影響，進(jìn)而對(duì)葛根素調(diào)控自噬的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　第一章 葛根素對(duì)心肌肥厚過程中自噬的影響
　　目的:分別通過動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察自噬在心肌肥厚中的時(shí)序性變化特點(diǎn)。在心肌肥厚模型基礎(chǔ)上，觀察葛根素治療對(duì)心肌細(xì)胞自噬的影響。
　　方法:通過腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)（aortic banding，AB）構(gòu)建大鼠心肌肥厚模型，分別在AB術(shù)后1w、2w、3w以及6w獲取大鼠心肌組織

5、，使用免疫印跡法(Westernblot)檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ、P62以及Beclin1的時(shí)序性表達(dá)。將所有大鼠分為4組，即假手術(shù)組（Sham組），腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)組(AB組)，AB組+葛根素治療組（Pue組，100mg/kg·d腹腔注射）以及AB+雷帕霉素組（Rapa組，1.2mg/kg·d腹腔注射）。治療3周后分別通過Western Blot和免疫組織熒光法檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3、P62以及Beclin1的表達(dá)。
　　結(jié)果:

6、 LC3Ⅱ、P62以及Beclin1在Sham組與AB術(shù)后1w中比較，差異無顯著性。與Sham組比較，AB術(shù)后2w及3w，LC3Ⅱ顯著下調(diào)(0.04±0.02 vs.0.10±0.02，P＜0.01;0.05±0.03 vs.0.10±0.02，P＜0.01)，P62顯著上調(diào)(0.37±0.06, vs.0.18±0.04，P＜0.01;0.31±0.06 vs.0.18±0.04，P＜0，01)，Beclin1無顯著差異，而在AB術(shù)后

7、6w與Sham組比較，LC3Ⅱ、Beclin1顯著上調(diào)(0.15±0.03 vs.0.10±0.02，P＜0.05;0.36±0.03 vs.0.19±0.02，P＜0.05)，P62顯著下調(diào)(0.05±0.03 vs.0.18±0.04，P＜0.01)。
　　結(jié)論:心肌肥厚早期自噬被顯著抑制，心肌肥厚后期自噬被顯著激活。與雷帕霉素相似，葛根素治療在心肌肥厚中具有自噬激活作用。
　　第二章 葛根素在心肌肥厚中通過調(diào)控自噬發(fā)揮

8、心臟保護(hù)作用
　　目的:觀察葛根素在心肌肥厚中對(duì)心肌細(xì)胞肥大和凋亡的抑制作用。通過干擾自噬調(diào)控，觀察對(duì)葛根素心肌保護(hù)作用的影響。
　　方法:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分為四組:Sham組，AB組，Pue+AB組（100mg/kg.d腹腔注射6周）及Rapa+AB組（1.2mg/kg.d腹腔注射6周）。心臟超聲心動(dòng)圖測定心室厚度及收縮功能;處死動(dòng)物后測量心臟/體重質(zhì)量比、左心室/體重質(zhì)量比;蘇木精-伊紅(HE)染色以及Masson染色評(píng)價(jià)心肌細(xì)

9、胞肥大及間質(zhì)重構(gòu);qRT-PCR檢測心肌組織肥大基因ANP、β-MHC mRNA表達(dá)。Western Blot檢測cleaved-caspase3(C-Casp3)，Tunnel染色檢測組織心肌細(xì)胞凋亡;體外實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(Con)、ISO組(1μM刺激H9C2細(xì)胞48h)、Pue組（1μM、5μM、20μM分別與ISO1μM共刺激心肌細(xì)胞48小時(shí)）。
　　結(jié)果:病理結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞面積及間質(zhì)纖維化在AB組較Sham組明顯增加，

10、在Pue和Rapa組分別較AB組明顯減小。Tunel法檢測心肌細(xì)胞凋亡率，結(jié)果表明:與Sham組(0.002±0.001)比較，AB術(shù)后6周心肌細(xì)胞凋亡率(0.101±0.022)明顯增加。AB術(shù)后分別給予葛根素和雷帕霉素治療，可較AB組明顯減少心肌細(xì)胞凋亡(0.008±0.002vs.0.101±0.022;0.008±0.002vs.0.101±0.022)。 C-Casp3蛋白表達(dá)在AB組（1.20±0.22）較Sham組（0.0

11、4±0.02）顯著上調(diào)，Pue組（0.04±0.01）與Rapa組（0.05±0.01）較AB組顯著下調(diào)。
　　結(jié)論:葛根素具有抑制心肌細(xì)胞肥大和細(xì)胞凋亡的作用。自噬可能是葛根素發(fā)揮心臟保護(hù)作用的機(jī)制之一。
　　第三章 葛根素通過AMPK/mTOR信號(hào)通路發(fā)揮自噬調(diào)控作用
　　目的:觀察葛根素在心肌肥大中對(duì)AMPK/mTOR信號(hào)通路的影響。通過特異性干擾AMPK基因表達(dá)，觀察對(duì)葛根素調(diào)控自噬以及心肌保護(hù)作用的影響

12、>　　方法:ISO(1μM)分別體外刺激心肌細(xì)胞3h、6h、12h以及24h。Pue(1μM、5μM、10μM以及20μM)與ISO(1μM)共孵育心肌細(xì)胞6h，western blot檢測p-AMPK、自噬標(biāo)志蛋白LC3以及凋亡蛋白C-Casp3，Hoechest33342染色觀察心肌細(xì)胞凋亡。通過藥物(Dorsomorphin，Dor)或RNAi技術(shù)特異性干擾MPK表達(dá)基礎(chǔ)上給予Pue（20μM）與ISO(1μM)共培養(yǎng)H9C2細(xì)胞

13、，觀察對(duì)Pue自噬調(diào)控以及心肌保護(hù)作用的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分別在AB術(shù)后1w、2w、3w以及6w觀察并比較AMPK激活的時(shí)序性變化。通過免疫共沉淀方法檢測AMPK/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:在AB術(shù)后2w開始，P-AMPK/T-AMPK較Sham組顯著下調(diào)(0.18±0.04vs.0.49±0.16)，但在AB術(shù)后6w（0.96±0.11）較Sham組（0.49±0.16）顯著上調(diào)。ISO(1μM)分別予體外刺激H9c

14、2細(xì)胞3h、6h可分別較Con組細(xì)胞顯著下調(diào)P-AMPK(0.18±0.06vs.0.93±0.04;0.20±0.05vs.0.93±0.04)，而分別刺激細(xì)胞12h、24h則較Con組細(xì)胞顯著上調(diào)P-AMPK(2.22±0.25vs.0.93±0.04;2.26±0.48vs.0.93±0.04,P＜0.01)。Pue(1μM)預(yù)處理心肌細(xì)胞24h，再給予ISO1μM共刺激心肌細(xì)胞6h，與ISO組比較，P-AMPK表達(dá)無顯著差異（0

15、.21±0.03vs.0.22±0.03，P=0.87）。在Pue組(5μM、10μM及20μM)中，P-AMPK分別較ISO組表達(dá)顯著增加(0.40±0.01vs.0.22±0.03;0.48±0.03vs.0.22±0.03;0.48±0.07vs.0.22±0.03)。Pue治療3周（0.87±0.06）可較AB組顯著上調(diào)P-AMPK。與Sham組比較，AB術(shù)后3周P-mTOR（1.55±0.09vs.0.54±0.02）及下游蛋

16、白P-4EBP1(2.19±0.34vs.1.09±0.018)、P-p70S6K(0.97±0.05 vs.0.33±0.01)表達(dá)顯著上調(diào);Pue治療3周后，可分別較AB組顯著下調(diào)P-mTOR（0.12±0.02vs.1.55±0.09）及下游蛋白P-4EBP1（0.89±0.10vs.2.19±0.34）、P-p70S6K（0.09±0.05vs.0.97±0.05）。與Con組(1.07±0.19)比較，ISO組（0.14±0.

17、11）明顯抑制LC3Ⅱ表達(dá)(P＜0.01);與ISO組比較，Met組（二甲雙胍1mM與ISO共刺激H9C2細(xì)胞）或Pue組（20μM共ISO共刺激H9C2細(xì)胞）可分別顯著上調(diào)LC3Ⅱ(1.03±0.23vs.0.14±0.11;1.20±0.35vs.0.14±0.11)。與Pue組比較，Dor組（5μM預(yù)刺激H9C2細(xì)胞4h，再予Pue+ISO共刺激H9C2細(xì)胞）可顯著下調(diào)LC3Ⅱ（0.09±0.08vs.1.20±0.35），增大細(xì)