自噬通過mTOR信號通路保護胃粘膜上皮細胞免于乙醇誘導的氧化損傷.pdf

1、第一部分乙醇抑制mTOR信號通路并誘導胃粘膜上皮細胞與組織自噬
　　目的：重建乙醇損傷胃粘膜上皮細胞與組織的模型，探索其中自噬的表達情況以及相關通路的調(diào)控作用與意義。
　　方法：胃粘膜上皮細胞系（GES-1細胞）與大鼠胃組織經(jīng)過不同濃度的乙醇干預后，通過MTT、流式細胞凋亡實驗、病理學評估等方法驗證細胞與組織的損傷情況，并采用Western blot、免疫熒光法與免疫組織化學法等技術檢測自噬相關蛋白的表達水平并評估 mTOR

2、信號通路的調(diào)控情況，從而探索自噬在乙醇誘導的胃粘膜上皮細胞中的分子機制。
　　結(jié)果：細胞實驗顯示乙醇干預可以抑制GES-1細胞增殖活力并誘導細胞凋亡，動物實驗顯示大鼠經(jīng)乙醇灌胃處理后胃粘膜切片可見胃小凹破壞及粘膜出血。此外，Western blot結(jié)果顯示乙醇能上調(diào)自噬相關蛋白Beclin-1與ATG12-ATG5的表達并促使LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化，而且這一過程伴隨著mTOR及其下游的p70S6激酶的去磷酸化。
　　

3、結(jié)論：乙醇誘導胃粘膜上皮細胞與組織損害，此外乙醇也可以通過抑制 mTOR信號通路誘導胃粘膜上皮細胞與組織自噬的產(chǎn)生。
　　第二部分調(diào)控細胞自噬對乙醇誘導的胃粘膜上皮細胞與組織損傷的影響及相關機制
　　目的：探究乙醇誘導的胃粘膜上皮細胞與組織的損傷與自噬之間的聯(lián)系以及作用機制。
　　方法：使用自噬抑制劑3-MA或采用Atg7-siRNA沉默自噬相關基因的方法抑制GES-1細胞自噬過程，乙醇干預后運用PCR或Western

4、 blot等技術測定自噬相關蛋白改變，采用MTT與流式細胞凋亡實驗等方法評估細胞增殖活性并檢測細胞凋亡過程；通過灌胃法使用自噬抑制劑CQ預處理大鼠胃粘膜，并經(jīng)乙醇干預后取胃組織做病理評分及H&E染色，評估胃粘膜的損傷情況，從而探討自噬在胃粘膜中的作用意義。
　　結(jié)果：細胞實驗中Western blot顯示抑制劑3-MA可以抑制GES-1細胞中LC3-II的生成，Atg7-siRNA可以通過沉默ATG7而抑制細胞自噬，MTT及流式凋

5、亡實驗數(shù)據(jù)顯示，相比于乙醇單獨干預，聯(lián)合3-MA或Atg7-siRNA增強乙醇對GES-1細胞損傷作用，即增殖活性更低且凋亡率更高；動物實驗結(jié)果顯示，與單用乙醇灌胃相比，使用CQ預處理可以增加乙醇誘導的胃粘膜損傷的病理評分以及更加嚴重的胃小凹損傷及粘膜出血。
　　結(jié)論：抑制細胞自噬可以增強乙醇誘導的胃粘膜上皮細胞或組織損傷，提示自噬在胃粘膜上皮細胞或組織中的保護作用。
　　第三部分細胞自噬參與調(diào)控乙醇誘導的胃粘膜上皮細胞與組

6、織氧化應激
　　目的：探討胃粘膜上皮細胞與組織中乙醇所誘導的氧化應激與自噬之間的相互關系。
　　方法：乙醇與自噬抑制劑分別或聯(lián)合干預GES-1細胞后采用DCFH-DA孵育，應用熒光酶標儀檢測細胞內(nèi) ROS的含量；乙醇或自噬抑制劑聯(lián)合或分別通過灌胃法飼喂大鼠，取胃粘膜組織勻漿后檢測其中SOD與MDA的表達水平。
　　結(jié)果：乙醇聯(lián)合自噬抑制劑干預GES-1細胞后DCF熒光強度明顯高于單用乙醇干預；乙醇聯(lián)合自噬抑制劑大鼠灌胃