自噬通過(guò)Stat3信號(hào)通路降低骨髓血細(xì)胞DNA的輻射損傷.pdf

1、目的：
　　研究細(xì)胞自噬對(duì)輻射所致DNA損傷的修復(fù)作用及其作用機(jī)制
　　方法：
　　1、采用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦熒光顯微鏡技術(shù)檢測(cè)小鼠全骨髓單個(gè)核細(xì)胞中帶熒光標(biāo)記γ-H2AX蛋白的表達(dá)情況。
　　2、采用堿性或中性的單細(xì)胞彗星電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中DNA雙鏈斷裂情況。
　　3、應(yīng)用免疫印跡方法檢測(cè)雷帕霉素（Rapamycin, Rap）處理后細(xì)胞中Stat3、自噬相關(guān)蛋白。
　　4、應(yīng)用熒光定量PCR檢

2、測(cè)慢病毒侵染后細(xì)胞中Stat3的mRNA水平。
　　5、應(yīng)用成像流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)處理后細(xì)胞的p-Stat3(Y705)在細(xì)胞核中的定位情況。
　　結(jié)果：
　　1、雷帕霉素對(duì)骨髓血細(xì)胞 DNA雙鏈的斷裂有輻射保護(hù)作用。無(wú)論在體內(nèi)還是體外，雷帕霉素處理組的骨髓單個(gè)核細(xì)胞輻照后產(chǎn)生的γ-H2AX都比單獨(dú)輻照組明顯降低。單細(xì)胞堿性彗星電泳實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)雷帕霉素處理組的細(xì)胞的彗星尾距也明顯地降低（為p<0.05），而能表征DNA雙鏈斷

3、裂（DSB）的中性彗星電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素處理輻照組比單獨(dú)輻照組所產(chǎn)生的DSB減少（p<0.05）。
　　2、雷帕霉素通過(guò)激活自噬實(shí)現(xiàn) DNA雙鏈斷裂損傷的輻射保護(hù)作用。蛋白印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素預(yù)處理后單個(gè)核細(xì)胞的自噬水平升高。用 BafA1抑制自噬后，雷帕霉素介導(dǎo)的輻照保護(hù)作用明顯被抑制。運(yùn)用造血系統(tǒng)特異性敲除Atg7的小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，在自噬缺失時(shí)，雷帕霉素介導(dǎo)的DSB損傷修復(fù)的作用受到抑制。
　　3、在對(duì)骨髓單

4、個(gè)核細(xì)胞的輻照保護(hù)作用中，Stat3的活性受到自噬調(diào)控。雷帕霉素預(yù)處理可以激活Stat3通路，抑制自噬或自噬缺陷都能明顯抑制Stat3的激活。
　　4、自噬對(duì)骨髓血細(xì)胞DNA的輻射保護(hù)作用依賴于Stat3。通過(guò)藥物抑制Stat3的活化或用shRNA干擾Stat3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Stat3活性受到抑制時(shí)，自噬介導(dǎo)的輻照保護(hù)作用受到削弱。
　　結(jié)論：
　　雷帕霉素預(yù)處理能降低輻照導(dǎo)致的骨髓細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的DNA損傷，這種作