Notch信號(hào)調(diào)控巨噬細(xì)胞參與心梗重塑的作用和分子機(jī)制研究.pdf

1、心肌梗死隨著其發(fā)病率和致死率的逐年攀升,已成為嚴(yán)重威脅國(guó)民身體健康的第一殺手。急性期心肌梗死主要的死亡原因是急性心衰竭,隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步,內(nèi)科藥物溶栓、介入支架和外科的搭橋手術(shù)使急性期心梗發(fā)展成急性心衰進(jìn)而導(dǎo)致死亡的幾率大幅度下降。但隨著病情的進(jìn)一步發(fā)展轉(zhuǎn)為慢性期。慢性期主要以心臟纖維化重塑為主,如果纖維重塑過(guò)度會(huì)引發(fā)慢性心衰導(dǎo)致死亡。然而,到目前為止預(yù)防和治療心臟纖維化重塑過(guò)度尚無(wú)好的方法。有研究表明,巨噬細(xì)胞極化在心梗后纖維化重塑

2、全程具有重要的調(diào)控作用。那么是否可以通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化實(shí)現(xiàn)對(duì)膠原纖維降解和生成的良性調(diào)控,進(jìn)而成為預(yù)防和治療心梗后心室惡性纖維化重塑的新途徑呢?
　　目前,許多信號(hào)通路參與巨噬細(xì)胞的極化。RBP-JК介導(dǎo)的經(jīng)典Notch信號(hào)通路是進(jìn)化上十分保守的信號(hào)通路,對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、凋亡及組織重塑等過(guò)程起重要的調(diào)控作用。我們實(shí)驗(yàn)室王耀春博士2010年在實(shí)體瘤的研究中首次發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)與巨噬細(xì)胞的極化密切相關(guān),阻斷RBP-JК介

3、導(dǎo)的Notch信號(hào)可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向 M2型極化,而同一年熊思東教授組的研究報(bào)道在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中, Notch1通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞向M2b的極化而參與了其病理進(jìn)程。2012年,曹雪濤院士研究組發(fā)現(xiàn),用γ分泌酶抑制劑阻斷Notch信號(hào)通路會(huì)促進(jìn)TLR誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),并促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化,同年《Nature Immunol》上發(fā)表了Notch信號(hào)通路通過(guò)上調(diào)IRF8促進(jìn)M1型極化的文章。這些研究均說(shuō)明Notch信號(hào)通路對(duì)巨噬細(xì)胞的極化

4、起重要的調(diào)控作用。然而,RBP-JК介導(dǎo)的Notch信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞參與組織損傷后重塑過(guò)程中是否也具有關(guān)鍵的調(diào)控作用尚無(wú)報(bào)道,是否能夠通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化來(lái)調(diào)節(jié)心梗后心室重塑也尚不明確。
　　基于上述問(wèn)題,本實(shí)驗(yàn)首次利用在巨噬細(xì)胞中特異剔除Notch信號(hào)的小鼠對(duì)巨噬細(xì)胞在組織損傷重塑過(guò)程中是否起作用進(jìn)行了探索,同時(shí)對(duì)其在心梗后重塑過(guò)程中的調(diào)控作用及其機(jī)制進(jìn)行了深入分析,這些研究為尋找治療和預(yù)防心梗后惡性纖維化重塑的新策略提供了理

5、論依據(jù),具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　目的：
　　1.探索 RBP-JК介導(dǎo)的Notch信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞參與組織損傷后重塑過(guò)程中的作用。
　　2.觀察心梗后阻斷巨噬細(xì)胞中的Notch信號(hào)通路對(duì)心梗區(qū)域及心臟內(nèi)、外單核/巨噬細(xì)胞的影響。
　　3.探尋Notch信號(hào)通路調(diào)控巨噬細(xì)胞參與心梗重塑過(guò)程中的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.構(gòu)建巨噬細(xì)胞中剔除 RBP-JК小鼠,并依據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分為實(shí)驗(yàn)組(RBP-

6、JК剔除小鼠)和對(duì)照組(RBP-JК野生小鼠或雜合小鼠)。
　　2.對(duì)12周左右小鼠實(shí)驗(yàn)組(10只)和對(duì)照組(16只)進(jìn)行高氏心梗模型的構(gòu)建,4周之后利用小動(dòng)物超聲對(duì)兩組小鼠的心臟功能及左室體重比進(jìn)行比較分析。
　　3.分離心梗后小鼠心臟和肺臟,稱重后對(duì)兩組小鼠心臟體重比和肺臟體重比進(jìn)行比較分析。
　　4.通過(guò)心梗小鼠心臟的大體圖片及石蠟切片的Masson染色對(duì)兩組小鼠心梗面積和纖維化重塑程度進(jìn)行比較分析。
　　

7、5.對(duì)8周左右小鼠實(shí)驗(yàn)組(12只)和對(duì)照組(12只)建立四氯化碳誘導(dǎo)的組織損傷模型,10周之后分離肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及心臟,通過(guò)大體圖片、組織切片的Masson染色和天狼星紅染色對(duì)組織損傷程度和纖維化重塑的程度進(jìn)行比較分析。
　　6.通過(guò)心臟石蠟切片的免疫熒光染色對(duì)兩組小鼠心梗區(qū)巨噬細(xì)胞數(shù)量及類型、細(xì)胞凋亡及新生血管數(shù)量進(jìn)行比較分析。
　　7.通過(guò)ELISA對(duì)兩組小鼠非梗死區(qū)HYP含量進(jìn)行比較分析。
　　8.通過(guò)

8、Q-PCR對(duì)兩組小鼠梗死區(qū)炎癥因子、抗炎因子及纖維化相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較分析。
　　9.采集心梗后兩組小鼠的血液并離心獲得上清,通過(guò) ELISA對(duì)血清中炎癥因子(TNF-α,IL-6)及抗炎因子(IL-10)進(jìn)行比較分析。
　　10.獲得心梗后兩組小鼠的血液、脾臟和骨髓,通過(guò)流式對(duì)心梗外組織中的單核/巨噬細(xì)胞進(jìn)行比較分析。
　　11.采用LPS加INF-γ誘導(dǎo)原代培養(yǎng)骨髓源的巨噬細(xì)胞向炎癥相關(guān)M1型巨噬細(xì)胞極化,通

9、過(guò)Western blot、流式和ELISA對(duì)兩組小鼠炎癥相關(guān)因子的表達(dá)及相關(guān)調(diào)控通路NF-κB信號(hào)通路進(jìn)行比較分析。
　　結(jié)果：
　　1.心梗4周后,兩組小鼠生存曲線無(wú)明顯區(qū)別。
　　2.心梗4周后,小動(dòng)物超聲顯示:敲除小鼠射血分?jǐn)?shù)(EF％)(54.04±7.293)高于對(duì)照組(36.03±4.034);左室短軸收縮率(FS%)(27.62±4.293)高于對(duì)照組(17.31±2.180);敲除小鼠左室舒張期前壁 L

10、VAWd(mm)(0.8613±0.07792)、后壁LVPWd(mm)(0.6676±0.01436)及室間隔厚度LVIWd(mm)(3.367±0.2837)薄于對(duì)照組(分別為0.6465±0.03634;0.7284±0.06317;4.382±0.1748);敲除小鼠左室舒張期容積LV Vol d(ul)(47.92±10.31)少于對(duì)照組(87.87±8.209)。
　　3.心梗4周后,敲除小鼠左室體重比、心臟體重比及肺

11、臟體重比均低于野生組。
　　4.心梗4周后,心臟大體圖片和組織切片MASSON染色均顯示心梗后敲除小鼠心臟梗死面積減少;此外,心臟 MASSON染色還顯示敲除心梗區(qū)心肌存活增多,梗死區(qū)域及非梗死區(qū)域纖維化重塑減輕。
　　5.在四氯化碳誘導(dǎo)的組織損傷模型中,10周后分離小鼠的肝臟、肺臟、脾臟、腎臟及心臟,通過(guò)大體圖片、Masson染色及天狼猩紅染色對(duì)兩組小鼠進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn),敲除小鼠肝臟、肺臟、脾臟、腎臟及心臟損傷輕于對(duì)照組,

12、同時(shí)各個(gè)器官的纖維化重塑程度也輕于對(duì)照組。
　　6.心梗4周后,通過(guò)免疫熒光染色,在激光共聚焦顯微鏡下對(duì)兩組小鼠進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)心梗后敲除小鼠梗死區(qū)域巨噬細(xì)胞減少,主要以炎癥相關(guān)的巨噬細(xì)胞減少為主,抗炎相關(guān)的巨噬細(xì)胞變化不明顯,梗死區(qū)域細(xì)胞凋亡減少,心梗區(qū)域、交接區(qū)域和非梗死區(qū)域新生血管無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　7.心梗4周后,ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)敲除小鼠血中炎癥相關(guān)因子(TNF-α,IL-6)和抗炎相關(guān)因子(IL-10)與對(duì)照

13、組相比較變化不明顯。
　　8.心梗4周后,大體圖片和脾臟體重比顯示敲除小鼠脾臟增大不明顯。
　　9.心梗4周后,流式細(xì)胞儀檢測(cè):心梗后敲除小鼠血、骨髓及脾臟中炎癥相關(guān)(LY6CHigh CD11b+)和抗炎相關(guān)(LY6CLow CD11b+)的單核細(xì)胞減少。此外,敲除小鼠脾臟中單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞(CD11b+F4/80+)減少,且炎癥相關(guān)的巨噬細(xì)胞(F4/80+iNOS+)減少。
　　10.LPS+INF-γ刺激原

14、代培養(yǎng)巨噬細(xì)胞2小時(shí)后,通過(guò)共聚焦顯微鏡檢測(cè):敲除小鼠P65入核減少,IκB降解減少。流式檢測(cè):敲除小鼠炎癥相關(guān)因子TNF-α表達(dá)減少。
　　11.LPS+INF-γ刺激原代培養(yǎng)巨噬細(xì)胞24小時(shí)后,細(xì)胞培養(yǎng)液ELISA檢測(cè):敲除小鼠巨噬細(xì)胞分泌炎癥相關(guān)因子(TNF-α,IL-6,IL-12)降低,抗炎相關(guān)因子(IL-10)升高。共聚焦顯微鏡檢測(cè):敲除小鼠炎癥相關(guān)因子TNF-α表達(dá)減少,P65和P50表達(dá)降低,IκB降解降低。蛋白印

15、跡檢測(cè):敲除小鼠巨噬細(xì)胞中CYLD表達(dá)升高, P65和P50表達(dá)降低,IκB降解降低。
　　結(jié)論：
　　1.以兩種不同形式的組織慢性損傷模型同時(shí)證明了巨噬細(xì)胞中RBP-JК介導(dǎo)的Notch信號(hào)通路與組織慢性損傷后重塑密切相關(guān)。阻斷巨噬細(xì)胞中的RBP-JК可以減輕組織損傷和纖維化重塑。
　　2.首次發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞中的Notch信號(hào)通路與心梗后心臟功能的恢復(fù)密切相關(guān)。阻斷巨噬細(xì)胞中的Notch信號(hào)通路可以減輕心梗后心臟損傷,

16、抑制纖維化重塑有助于心臟功能的恢復(fù),為改善心梗后心臟功能及治療和預(yù)防心梗后惡性纖維化重塑提供一個(gè)新的思路。
　　3.首次發(fā)現(xiàn)阻斷巨噬細(xì)胞中的Notch信號(hào)通路可以抑制梗死區(qū)域的巨噬細(xì)胞向炎癥相關(guān)M1型極化而對(duì)抗炎相關(guān)的M2型極化沒(méi)有影響,并且影響心梗以外其他組織(血液、骨髓及脾臟)中炎癥相關(guān)單核細(xì)胞生成,進(jìn)而減少炎癥相關(guān)巨噬細(xì)胞的來(lái)源,為Notch信號(hào)通路在體內(nèi)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制提供了一個(gè)新的思考方向。
　　4.在體外實(shí)

17、驗(yàn)中證明了阻斷巨噬細(xì)胞中的Notch信號(hào)可抑制P65及P50的表達(dá),促進(jìn)CYLD上調(diào)抑制IκB降解和P65入核,進(jìn)而使NF-κB信號(hào)通路活化受阻,導(dǎo)致炎癥因子分泌減少。同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn)阻斷巨噬細(xì)胞中的Notch信號(hào)可以促進(jìn)抗炎相關(guān)因子IL-10分泌,提示體外阻斷巨噬細(xì)胞中的Notch信號(hào)可抑制其向M1型極化,促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化。
　　總之,這些研究為尋找治療和預(yù)防心梗后惡性纖維化重塑的新策略提供了理論依據(jù),具有潛在的臨床應(yīng)用