miRNA分子與Notch途徑的相互作用對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的調(diào)控機(jī)制的初步研究.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤（glioma）是起源于神經(jīng)外胚層的惡性腫瘤。腦膠質(zhì)瘤占所有原發(fā)性腦腫瘤的32％，其中80%為惡性膠質(zhì)瘤。一般將神經(jīng)膠質(zhì)瘤分為四個(gè)級(jí)別：Ⅰ級(jí)﹑Ⅱ級(jí)﹑Ⅲ級(jí)與Ⅳ級(jí)，隨著級(jí)別的上升膠質(zhì)瘤的惡性程度增加。由于目前還不能完全了解膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制與發(fā)病原因，所以無(wú)法從根本上抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展。同時(shí)膠質(zhì)瘤具有向周邊正常組織遷移及侵襲的能力，而且膠質(zhì)瘤患者復(fù)發(fā)的幾率很大，因此目前的醫(yī)療技術(shù)只能使神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者短暫地延長(zhǎng)存活時(shí)間而無(wú)法達(dá)到根

2、治的效果。即使早期手術(shù)﹑藥物及化療有一定的療效，但患者治療后的平均生存期也僅為14個(gè)月。如何發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤高效特異的診斷、治療和監(jiān)測(cè)靶點(diǎn)并且防止膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)成為其治療的重要環(huán)節(jié)。
　　MicroRNAs（miRNAs）發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)90年代，是一類(lèi)大約含有22個(gè)核苷酸的非編碼小RNA分子。雖然發(fā)現(xiàn)的時(shí)間不長(zhǎng)，但已成為目前醫(yī)學(xué)界研究的明星分子。miRNAs參與很多腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中miRNAs也起到很重要的調(diào)控作用，提示mi

3、RNAs對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷和治療可能具有較好的應(yīng)用前景。但哪些 miRNAs分子在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用？其調(diào)控機(jī)制如何？目前還不完全清楚。
　　Notch信號(hào)途徑具有在進(jìn)化上高度保守的特性，其相關(guān)分子在非脊椎動(dòng)物﹑脊椎動(dòng)物中都有不同程度的表達(dá)。許多研究已經(jīng)證實(shí) Notch信號(hào)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生﹑發(fā)展﹑侵襲以及血管的生成中起著重要的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)也有研究指出多種miRNAs分子參與Notch信號(hào)途徑。但是Notch信

4、號(hào)與miRNA的具體關(guān)系及其意義，目前仍缺少相關(guān)報(bào)道。
　　本研究室在前期研究中在不同系統(tǒng)對(duì)Notch信號(hào)的下游miRNA分子進(jìn)行了篩選，鑒定出一批潛在的Notch下游分子，并對(duì)其作用進(jìn)行了初步研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，采用細(xì)胞培養(yǎng)、miRNA轉(zhuǎn)染、報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、細(xì)胞生物學(xué)觀察、結(jié)合部分臨床標(biāo)本的研究，對(duì)的三種miRNA分子的作用特性及在膠質(zhì)瘤中的潛在作用進(jìn)行了初步研究。主要發(fā)現(xiàn)如下：
　　1.初步觀察了Notch信號(hào)潛在下

5、游miRNA（miR-342-5p）對(duì)幾種下游分子的直接調(diào)控作用。
　　構(gòu)建了miR-342-5p的潛在下游分子ph2，ph3，Araf，PFN2和GAS2的報(bào)告基因載體；利用報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)了miR-342-5p對(duì)上述報(bào)告基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因的3’-UTR并不受miR-342-5p的直接調(diào)控，提示miR-342-5p存在其他的靶基因，或者其調(diào)控作用不通過(guò)3’-UTR發(fā)揮。
　　2.初步觀察了miR-9對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)

6、胞的影響。
　　采用細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、細(xì)胞生物學(xué)觀察等方法初步探討了miR-9對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響。初步結(jié)果顯示miR-9可以調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞突起的生長(zhǎng)，但對(duì)細(xì)胞的遷移似乎沒(méi)有明顯的影響。
　　3．初步探討了miR-188-5p對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用。
　　利用培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和合成的miR-188-5p的mimics和inhibitor，觀察了miR-188-5p對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移有影響。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-188-

7、5p可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移。進(jìn)一步通過(guò)transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-188-5p可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲。此外，還檢測(cè)了miR-188-5p是否對(duì)細(xì)胞的增殖有影響，即通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)染色膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖相關(guān)抗原的表達(dá)，證實(shí)miR-188-5p對(duì)細(xì)胞的增殖并無(wú)影響。
　　進(jìn)一步探討了miR-188-5p是通過(guò)什么機(jī)制來(lái)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移與侵襲的。鑒于MMPS家族分子，尤其是MMP2對(duì)細(xì)胞的遷移與侵襲的重要影響，在前期本科室的研

8、究發(fā)現(xiàn)MMP2、MMP13是miR-188-5p的靶基因的基礎(chǔ)上，觀察了多種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中MMPS分子的表達(dá)。通過(guò)WB實(shí)驗(yàn)證實(shí)在所檢測(cè)的幾種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中都有miR-188-5p與MMPs分子的表達(dá)，并且初步證實(shí)miR-188-5p可以抑制MMPs分子的表達(dá)。
　　在上述工作的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一定程度的體內(nèi)觀察。分別提取膠質(zhì)瘤腫瘤組織與瘤旁正常組織的蛋白與RNA。首先通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)在腫瘤組織中miR-188-5p的表達(dá)量低

9、于正常組織；其次通過(guò)WB實(shí)驗(yàn)證實(shí)在腫瘤組織中MMPs的表達(dá)量高于正常組織。這與細(xì)胞水平驗(yàn)證的結(jié)果完全一致。此外，在前期工作和文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道 Notch信號(hào)途徑的相關(guān)分子在膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展中起著很重要調(diào)控作用的基礎(chǔ)上，檢測(cè)了腫瘤組織中 Notch信號(hào)途徑相關(guān)分子的表達(dá)。通過(guò)WB實(shí)驗(yàn)證實(shí)在腫瘤組織中Notch下游分子Hes1、Hes5的表達(dá)量高于正常組織。
　　結(jié)論：
　　通過(guò)本課題研究，成功構(gòu)建了miR-342-5p的潛在下游

10、分子ph2，ph3，Araf，PFN2和GAS2的報(bào)告基因載體，發(fā)現(xiàn)這些基因的3’-UTR并不受miR-342-5p的直接調(diào)控；發(fā)現(xiàn)miR-9可以調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞突起的生長(zhǎng)，但對(duì)細(xì)胞的遷移似乎沒(méi)有明顯的影響；發(fā)現(xiàn)miR-188-5p可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，而對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)顯著影響；初步證實(shí)MMPs是miR-188-5p的下游靶分子，可能參與了Notch信號(hào)途徑對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的調(diào)控作用。這些結(jié)果對(duì)于認(rèn)識(shí)Notch信號(hào)途徑以及miR