LRIG1對(duì)人膠質(zhì)瘤的抑制作用及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分LRIG1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義 目的：研究LRIG1及EGFR在不同級(jí)別星形細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)及其意義，探討LRIG1在星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況及其與腫瘤惡性程度的關(guān)系。 方法：分別應(yīng)用半定量RT-PCR的方法檢測(cè)LRIG1和EGFRmRNA在35例星形細(xì)胞瘤及4例正常腦組織中的表達(dá)水平，免疫組化方法檢測(cè)56例星形細(xì)胞瘤標(biāo)本及4例正常腦組織中LRIG1和EGFR蛋白的表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)分析其在低級(jí)別(WHOⅠ～Ⅱ級(jí))和

2、高級(jí)別(WHOⅢ～Ⅳ級(jí))星形細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)差異性。 結(jié)果：在35例星形細(xì)胞腫瘤中，32例有EGFRmRNA表達(dá)，EGFR在低級(jí)別(WHOⅠ～Ⅱ級(jí))與高級(jí)別(WHOⅢ～Ⅳ級(jí))星形細(xì)胞瘤中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)有顯著性差異(P=0.018)。WHO分級(jí)與EGFRmRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.482，P=0.002)。25例有LRIG1mRNA表達(dá)；在低級(jí)別(WHOⅠ～Ⅱ級(jí))與高級(jí)別(WHOⅢ～Ⅳ級(jí))星形細(xì)胞瘤中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)無(wú)顯著性差異。在星形細(xì)

3、胞瘤中，LRIG1和EGFRmRNA表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.159，P=0.362)。免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明，EGFR在腫瘤中陽(yáng)性率68％，與正常腦組織相比，差異有顯著性(P=0.023)；低度惡度膠質(zhì)瘤(WHOⅠ～Ⅱ級(jí))EGFR陽(yáng)性表達(dá)率55％(16/29)，而高度惡度膠質(zhì)瘤(WHOⅢ～Ⅳ級(jí))EGFR陽(yáng)性表達(dá)率為81％(22/27)，差異顯著(P=0.035)；WHO分級(jí)與EGFR蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.5597，P＜0.001)。

4、LRIG1在腫瘤中的陽(yáng)性率低度惡度膠質(zhì)瘤LRIG1(WHOⅠ～Ⅱ級(jí))陽(yáng)性表達(dá)率為24％(7/27)，高度惡度膠質(zhì)瘤(WHOⅢ～Ⅳ級(jí))LRIG1陽(yáng)性表達(dá)率29％(8/29)，兩組之間差異無(wú)顯著性(P=0.871)與正常腦組織相比，差異有顯著性(P=0.011)。 結(jié)論：LRIG1的表達(dá)強(qiáng)度同EGFR的表達(dá)強(qiáng)度及腫瘤的惡性程度沒(méi)有明確的關(guān)系；LRIG1的低表達(dá)和缺失在不同級(jí)別星形細(xì)胞瘤中普遍存在，LRIG1的異?？赡茉谛切渭?xì)胞瘤形成

5、的早期就已出現(xiàn)，可能參與星形細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展。 第二部分EGF對(duì)H4神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞LRIG1與EGFR表達(dá)的影響 目的：本研究通過(guò)EGF體外干預(yù)的方法探討在膠質(zhì)瘤中LRIG1的作用環(huán)境和可能存在的和EGFR間的相互影響，證實(shí)LRIG1對(duì)EGFR的抑制作用。 方法：采用RT-PCR和Westernblot法對(duì)不同劑量點(diǎn)(0.1、1、10、100ng/ml)和時(shí)間點(diǎn)(24、48、96h)EGF作用的H4神經(jīng)

6、膠質(zhì)瘤細(xì)胞LRIG1和EGFRmRNA及其蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。 結(jié)果：LRIG1和EGFR的表達(dá)均有時(shí)間和劑量依賴性，但是并不同步。兩者間的變化有相關(guān)性。 結(jié)論：1、EGF可誘導(dǎo)LRIG1的表達(dá)，LRIG1可能對(duì)EGFR有抑制作用；2、LRIG1的上調(diào)同大劑量EGF和/高表達(dá)的EGFR蛋白有關(guān)；3、小劑量的EGF作用下和/或EGFR蛋白上調(diào)緩慢的情況下并無(wú)LRIG1的明顯上調(diào)。 第三部分LRIG1基因逆

7、轉(zhuǎn)人膠質(zhì)瘤侵襲性的機(jī)制 目的：探討LRIG1基因抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、浸潤(rùn)的分子機(jī)制。 方法：應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將pcDNA3.1-LRIG1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人神經(jīng)膠質(zhì)瘤H4和U251細(xì)胞系，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)LRIG1和EGFR的表達(dá)，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Westernblot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前、后H4細(xì)胞LRIG1和EGFR基因mRNA和蛋白表達(dá)水平。用Boyden小室體外侵襲試驗(yàn)觀察H4

8、和U251細(xì)胞通過(guò)人工重組基底膜能力的變化。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LRIG1質(zhì)粒后，H4和U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞的LRIG1mRNA和蛋白表達(dá)均較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P＜0.01)；而EGFRmRNA和蛋白表達(dá)均較對(duì)照組明顯減弱(P＜0.01)。LRIG1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的H4細(xì)胞穿過(guò)人工重組基底膜的相對(duì)百分率分別為13.3±1.8％、11.2±0.9％，明顯低于未處理組和轉(zhuǎn)染空載體組的穿膜細(xì)胞百分率24.7±1.8％、

9、24.0±1.5％(P=0.008和P=0.010)，28.9±1.6％、27.5±1.2％(P＜0.001)。 結(jié)論：EGFR的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的侵襲、浸潤(rùn)；LRIG1通過(guò)抑制EGFR逆轉(zhuǎn)了惡性膠質(zhì)瘤侵襲、浸潤(rùn)。 第四部分LRIG1誘導(dǎo)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及其分子機(jī)制 目的：通過(guò)研究LRIG1誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡作用來(lái)探討LRIG1對(duì)EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制效應(yīng)的分子機(jī)制。 方法：采用Lip

10、ofectamine介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將質(zhì)粒pcDNA3.1-LRIG1轉(zhuǎn)染H4和U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Westernblot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后H4細(xì)胞LRIG1和EGFR的mRNA與蛋白水平的變化，Westernblot方法檢測(cè)H4細(xì)胞PKCα、Bax、bcl-2蛋白水平的變化。MTT法和流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞的增殖和凋亡的變化。 結(jié)果：H4細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LR

11、IG1組中LRIG1mRNA的表達(dá)水平(1.997±0.114)較未處理組(0.500±0.031)和轉(zhuǎn)染空載體組(0.357±0.035)明顯升高，差異有顯著性(P＜0.0001)；LRIG1的蛋白表達(dá)(1.790±0.119)較未處理組(0.717±0.038)和轉(zhuǎn)染空載體組(0.930±0.076)明顯升高，差異有顯著性(P＜0.0001和P=0.001)；而EGFRmRNA的表達(dá)水平(0.463±0.033)較對(duì)照組(1.157

12、±0.067)和轉(zhuǎn)染空載體組(0.933±0.058)明顯降低，差異有顯著性(P＜0.0001和P=0.002)；EGFR的蛋白表達(dá)(0.703±0.067)較對(duì)照組(1.280±0.078)和轉(zhuǎn)染空載體組(1.163±0.068)明顯降低，差異有顯著性(P=0.003和P=0.009)。PKCα、Bax表達(dá)上調(diào)，bcl-2表達(dá)下降，膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，凋亡顯著增強(qiáng)(P＜0.0001)。 結(jié)論：LRIG1通過(guò)參與形成EGFR