IL-33過表達對鼠腦膠質(zhì)瘤生長的抑制作用及其機制的相關(guān)研究.pdf

1、由于血腦屏障的存在,在一段時間內(nèi),中樞神經(jīng)系統(tǒng)被認為是免疫豁免器官,但是越來越多的研究發(fā)現(xiàn),腦組織在一定條件下是可以發(fā)生免疫應(yīng)答的。在病理條件下,由于血腦屏障通透性發(fā)生改變,中樞神經(jīng)系統(tǒng)可以有T細胞、NK細胞、巨噬細胞的浸潤從而發(fā)生免疫應(yīng)答。相比腫瘤細胞的免疫逃逸和耐受,中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫應(yīng)答作用是微乎其微的,因此,如何增強中樞神經(jīng)系統(tǒng)對腫瘤細胞的免疫應(yīng)答,特別是如何將免疫殺傷細胞向腦組織病灶大量定向募集成為了眾學(xué)者的研究熱點。已經(jīng)有報

2、道證實淋巴細胞體內(nèi)被激活后,可穿透血腦屏障,因此研究者們可以通過靶向免疫治療腦膠質(zhì)瘤,使之成為抗腫瘤治療的輔助治療之一。自從腦膠質(zhì)瘤特異性標(biāo)志抗原被發(fā)現(xiàn)及鑒定后,以及體外培育技術(shù)的不斷提高,采用特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)針對腦膠質(zhì)瘤進行過繼治療,是生物治療研究領(lǐng)域目前最令人期待的之一。有報道指IL-33不僅可以通過其特定受體ST2介導(dǎo)TH2型免疫反應(yīng),也可以通過相關(guān)機制直接作用于NK、DC、CTL等免疫細胞,不但能促進免疫細胞對

3、腫瘤細胞的直接殺傷,也能促進其釋放相關(guān)細胞因子間接殺死腫瘤細胞,起到免疫放大作用。無論是對于天然免疫還是獲得性免疫,IL-33都起著至關(guān)重要的作用。無論是感染性、自身免疫性疾病,還是腫瘤性疾病,IL-33都具有很強的研究價值。關(guān)于IL-33與腫瘤的關(guān)系,目前在非中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤方面的研究已取得新進展。IL-33少量表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的某些細胞中,在正常細胞中是以核因子的形式存在,只有當(dāng)細胞壞死崩解之后,才會被釋放到細胞外。如何在中樞神經(jīng)

4、系統(tǒng)中使IL-33具有一定的有效濃度是本實驗首先要解決的問題。通過質(zhì)粒和慢病毒為載體轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞系GL261,研究IL-33能否在GL261中表達并持續(xù)高表達,是所有試驗?zāi)芊耥樌M行的關(guān)鍵。將能穩(wěn)定過表達IL-33的GL261細胞注入體內(nèi),NK等免疫細胞發(fā)揮免疫殺傷作用,GL261細胞壞死崩解并釋放出大量的IL-33,這時我們就可以利用IL-33的免疫放大作用,調(diào)動體內(nèi)DC、NK、CTL等免疫細胞發(fā)揮腫瘤抗原提呈和免疫殺傷作用,從而在

5、腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展階段殺死腫瘤細胞,抑制膠質(zhì)瘤的生長。為了深入研究過表達IL-33對腦膠質(zhì)瘤生長抑制的作用機制,我們在本實驗中也引入了CTL的過繼治療。為了明確IL-33是否存在普遍的抗腫瘤現(xiàn)象,我們在體內(nèi)試驗部分利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了IL-33的B16-F10建立黑色素瘤載瘤模型,作為對照組。這些新的發(fā)現(xiàn)及研究將為腦膠質(zhì)瘤特別是高級別腦膠質(zhì)瘤的治療提供新的方向,為其臨床應(yīng)用提供堅實的理論基礎(chǔ)。
　　第一章鼠IL-33質(zhì)粒的構(gòu)建及其在G

6、L261中過表達的初步研究
　　目的：構(gòu)建鼠IL-33質(zhì)粒并探討其在小鼠多形性膠質(zhì)母細胞瘤細胞系GL261中過表達的可行性。方法：從Genebank找出鼠IL-33基因全長序列,通過人工合成,裝載于表達載體pEZ-M03,大量擴增后酶切鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒利用LipofectamineTMLTX轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染GL261,采用實時定量PCR和RT-PCR檢測目的基因的表達量;ELISA法檢測目的蛋白的表達量。結(jié)果：成功構(gòu)建了鼠IL-

7、33真核質(zhì)粒pEZ-M03-mIL33,經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑成功轉(zhuǎn)染GL261。經(jīng)熒光檢測,轉(zhuǎn)染后48小時轉(zhuǎn)染效率最高。實時定量PCR,RT-PCR檢測,目的基因高表達。ELISA法檢測到轉(zhuǎn)染細胞株中目的蛋白明顯高表達。結(jié)論：成功構(gòu)建的鼠IL-33真核質(zhì)粒在GL261中獲得高表達,為進一步慢病毒建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系和后期的功能性研究打下基礎(chǔ)。
　　第二章穩(wěn)定表達鼠IL-33的GL261細胞株的建立及體外功能研究
　　目的：利用成功

8、包被目的基因的慢病毒顆粒為載體,建立穩(wěn)定高表達鼠IL-33的GL261細胞株,并行體外功能研究,為進一步體內(nèi)研究奠定基礎(chǔ)。方法：利用包被鼠IL-33基因的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染GL261,在含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基的篩選下,大量擴增陽性克隆,并觀察轉(zhuǎn)染后的GL261細胞體外生長狀況。通過實時定量PCR和RT-PCR檢測目的基因的表達量;Western-blot法及ELISA法檢測目的蛋白的表達量,Transwell侵襲實驗檢測其侵襲性。結(jié)果：慢病

9、毒顆粒成功轉(zhuǎn)染GL261,在含濃度為6μg/ml的嘌呤霉素完全培養(yǎng)基的篩選出陽性克隆。大量擴增陽性克隆,通過實時定量PCR、RT-PCR、Westernblot法及ELISA法檢測到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中目的基因和蛋白明顯高表達。轉(zhuǎn)染后GL261細胞生長狀態(tài)和侵襲性不受影響。結(jié)論：成功利用包被目的基因的慢病毒顆粒感染GL261,建立了穩(wěn)定過表達鼠IL-33的GL261細胞株,并且其生長狀態(tài)和侵襲性均不受影響,為進一步體內(nèi)研究打下了基礎(chǔ)。

10、>　　第三章過表達鼠IL-33對鼠腦膠質(zhì)瘤生長抑制作用的體內(nèi)研究
　　目的：通過建立小鼠腦膠質(zhì)瘤模型,觀察正常和不同免疫細胞缺陷的小鼠顱內(nèi)腫瘤生長情況。聯(lián)合CTL過繼治療,探討IL-33抑制腦膠質(zhì)瘤生長的免疫機制。方法：立體定向儀指引下,選取SPF級別C57、Balb/c-NU、NOD/SCID鼠為載瘤動物建立腦膠質(zhì)瘤模型。其中C57同種群小鼠間,以ASGM1封閉NK與否劃分為兩類。分別以IL-33陽性和陰性克隆GL261及空載G

11、L261細胞建立模型,NK封閉IL-33陽性克隆組聯(lián)合CTL免疫過繼治療。流式細胞術(shù)檢測小鼠NK細胞封閉效果;7.0T磁共振法動態(tài)觀測小鼠顱內(nèi)成瘤情況。取出腦組織行石蠟切片,HE染色法檢測成瘤情況;免疫組化法檢測腦組織中IL-33的分布;免疫熒光法觀測組織中CD8、CD31表達情況。以小鼠黑色素瘤瘤細胞系B16-F10作為對照組,按照與GL261相同的分組方法建立皮下成瘤模型,并動態(tài)觀察成瘤情況。結(jié)果：成功建立了各種小鼠腦膠質(zhì)瘤瘤模型,

12、流式細胞檢測證實ASGM1能夠有效抑制C57體內(nèi)NK活性,在免疫力正常的C57小鼠中IL-33陽性克隆組磁共振及HE切片均未發(fā)現(xiàn)有腫瘤生長,而剩余的各類小鼠均有腫瘤生長。免疫組化證實了IL-33在接種小鼠腦組織內(nèi)有大量表達。免疫熒光證實了接種了IL-33陽性克隆細胞的小鼠腦組織中CD8高表達。成功建立了各類小鼠皮下黑色素瘤模型,通過對比各組小鼠皮下腫瘤生長速度,證實轉(zhuǎn)染了IL-33的B16-F10在正常C57小鼠中的生長速度慢于其他組。