敲低miR-221和miR-222表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤的抑制作用及機(jī)制的研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的46%。惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)病率為5-8/100，000，世界衛(wèi)生組織1998年公布按死亡率順序排位，惡性膠質(zhì)瘤是34歲以下腫瘤患者的第2位死亡原因，是35～54歲患者的第4位死亡原因。由于膠質(zhì)瘤的侵襲性生長，手術(shù)難以完全切除；化療和放療既不能高度特異性地殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞，治療效果差，又可能產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒、副作用。上述情況在近30年的臨床實(shí)踐中未得到根本改善，因此腦膠質(zhì)瘤仍是神經(jīng)外科領(lǐng)域的難

2、治性疾病，闡明發(fā)病機(jī)理、尋找新的治療手段的仍然是神經(jīng)外科的熱點(diǎn)課題。 目前分子病理學(xué)認(rèn)為膠質(zhì)瘤本質(zhì)上是一種多基因異常疾病，通過一種/多種癌基因的過表達(dá)、同時(shí)伴隨抑癌基因的突變?nèi)笔亩剐盘?hào)傳導(dǎo)通路異常，腫瘤細(xì)胞逃避了正常生長調(diào)控機(jī)制，自主進(jìn)行增殖和侵襲、出現(xiàn)惡性表型。近年來研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRNA或miRNA）為長度約21～25核苷酸的小型非編碼RNA，這些miRNA通過與靶mRNA的3'非編碼區(qū)結(jié)合，可在轉(zhuǎn)錄后水

3、平通過促進(jìn)靶mRNA降解和/或抑制其翻譯而發(fā)揮負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的作用。已有研究證明超過50%的miRs定位在癌相關(guān)基因區(qū)域或在脆弱區(qū)域，尤其是發(fā)現(xiàn)有些miRs在腫瘤細(xì)胞與相應(yīng)正常細(xì)胞中的表達(dá)截然不同，這使人們有理由相信miRs與腫瘤生成有關(guān)。同樣，在研究膠質(zhì)瘤miRs表達(dá)譜時(shí)發(fā)現(xiàn)一些miRs表達(dá)與正常星形細(xì)胞不同，其中miR-221和miR-222的表達(dá)明顯高于正常星形細(xì)胞。miR-221和miR-222是通過調(diào)控哪些靶基因的表達(dá)來促進(jìn)膠

4、質(zhì)瘤的生成，敲低膠質(zhì)瘤miR-221和miR-222表達(dá)是否可以逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤的惡性表型，從而成為膠質(zhì)瘤新的治療靶點(diǎn)，這些都是值得關(guān)注的重要課題。為此，本研究將著重探索miR221和miR222在膠質(zhì)瘤惡性表型中所起的作用，通過體內(nèi)外研究來證實(shí)敲低膠質(zhì)瘤miR-221和miR-222表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤生長的抑制作用。通過鑒定miR221和miR222的靶基因來探討敲低膠質(zhì)瘤miR-221和miR-222表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤抑制作用的機(jī)制。通過聯(lián)合放射治療

5、來探討敲低膠質(zhì)瘤miR-221和miR-222與放療是否具有抑制膠質(zhì)瘤生長的協(xié)同作用。 本研究分為五個(gè)部分進(jìn)行： 1．分析膠質(zhì)瘤中miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，并通過人工合成2'-O-methyl（OMe）修飾的反義寡核苷酸（As-miR-221和As-miR-222）敲低膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞中miR-221和miR-222的表達(dá)來系統(tǒng)分析miR-221和miR-222對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生、進(jìn)展所起的作用。 2用脂

6、質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染As-miR-221/222于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251，敲低miR-221和miR-222表達(dá)，觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞周期、侵襲能力及細(xì)胞凋亡等生物學(xué)性狀的變化。 3通過生物信息學(xué)的方法獲得miR-221和miR-222的潛在靶基因，并通過熒光素酶報(bào)告載體策略進(jìn)行鑒定，初步探討敲低膠質(zhì)瘤miR-221和miR-222表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤生長的作用機(jī)制。 4構(gòu)建U251裸鼠皮下荷瘤模型，進(jìn)行反義miRNA22

7、1/222的體內(nèi)治療，觀察腫瘤生長速度與體積，將腫瘤組織進(jìn)行免疫組化染色和原位雜交分析，進(jìn)一步驗(yàn)證反義miRNA221/222治療后腫瘤靶基因的表達(dá)變化以及與細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期，侵襲及凋亡的關(guān)系。 5通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲低膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞的miR-221和miR-222表達(dá)對(duì)放射治療是否具有增敏效果。 通過本實(shí)驗(yàn)，可以得出以下幾個(gè)結(jié)論： 1．膠質(zhì)瘤中存在一系列miRNA表達(dá)異常，miR-221和mi

8、R-222是其中表達(dá)上調(diào)的成簇miRs，miR-221過表達(dá)可以被認(rèn)為是人腦膠質(zhì)瘤新的分子標(biāo)簽。 2．p27kip1、PUMA、PTEN、TIMP3、Cx43基因mRNA的3’UTR是miR-221和miR-222直接作用靶點(diǎn)。 3．Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染2’-O-methyl（OMe）修飾的反義寡核苷酸-As-miR-221/222可有效敲低miR-221和miR-222在U251人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞

9、系的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)靶基因的表達(dá)，從而其惡性表型得以逆轉(zhuǎn)，包括細(xì)胞的增殖和侵襲能力受到抑制，出現(xiàn)G0/G1期阻滯，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 4．裸鼠皮下膠質(zhì)瘤模型應(yīng)用Lipofectamine2000介導(dǎo)的As-miR-221/222治療，同樣可有效敲低miR-221和miR-222的表達(dá)，增加靶基因的表達(dá)（p27kip1、PUMA、PTEN、TIMP3、Cx43），從而抑制腫瘤的生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與體外試驗(yàn)結(jié)果一致。 5．敲低