miR-221促進(jìn)N-myc表達(dá)對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖的作用與機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：
　　N-myc擴(kuò)增與神經(jīng)母細(xì)胞瘤（Neuroblastoma，NB）惡性表型和快速進(jìn)展密切相關(guān)，然而促發(fā)N-myc擴(kuò)增的機(jī)制尚未闡明。文獻(xiàn)報(bào)道，微小RNA-221（microRNA-221，miR-221）在N-myc擴(kuò)增的NB中表達(dá)上調(diào)。本課題以miR-221為切入點(diǎn)，結(jié)合臨床病例，分析miR-221在NB中的表達(dá)，及與N-myc表達(dá)和患者臨床病例特征的相關(guān)性，通過(guò)NB細(xì)胞的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，探討miR-221對(duì)NB細(xì)胞

2、增殖的影響及對(duì)N-myc表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1.miR-221在NB中的表達(dá)及其與N-myc表達(dá)和臨床病例特征相關(guān)性分析：收集31例NB患兒病例資料及石蠟切片，鎖核酸原位雜交（Locked nucleic acid-in situ hybridization，LNA-ISH）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qRT-PCR）檢測(cè)NB組織中miR-221表達(dá)，免疫組化檢測(cè)

3、NB組織中N-myc表達(dá)，分析miR-221與N-myc表達(dá)和NB臨床病例特征的相關(guān)性；qRT-PCR和Western blot檢測(cè)四種NB細(xì)胞系（SH-SY5Y、SK-N-SH、SK-N-DZ和IMR-32）中miR-221、N-myc表達(dá)。
　　2.miR-221對(duì)NB增殖的影響：構(gòu)建miR-221過(guò)表達(dá)慢病毒載體并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)和對(duì)照載體的細(xì)胞株（分別命名為miR-221-up和control細(xì)胞），qRT-PCR檢測(cè)m

4、iR-221的表達(dá)水平，CCK8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化；將SH-SY5Y，control及miR-221-up細(xì)胞分別接種至裸鼠背部皮下，建立裸鼠移植瘤模型，動(dòng)態(tài)觀察移植瘤的生長(zhǎng)，測(cè)量瘤體重量和體積，Ki67染色檢測(cè)移植瘤細(xì)胞增殖能力。
　　3.miR-221促進(jìn)N-myc擴(kuò)增的分子機(jī)制：qRT-PCR和Western blot檢測(cè)SH-SY5Y，control及miR-221-up細(xì)胞和移植

5、瘤中NLK，LEF1，p-LEF1，N-myc mRNA和蛋白的表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞中 NLK，p-LEF1，N-myc蛋白的表達(dá)，免疫組化檢測(cè)移植瘤中NLK，p-LEF1，N-myc蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.qRT-PCR和LNA-ISH結(jié)合免疫組化結(jié)果顯示miR-221在N-myc高表達(dá)的NB組織中表達(dá)顯著增多（p＜0.05）；臨床病例統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)miR-221表達(dá)與NB患兒生存時(shí)間成負(fù)相關(guān)，miR-221高表

6、達(dá)者生存時(shí)間短（p=0.0425）；但miR-221表達(dá)水平與NB患兒年齡、性別、腫瘤大小、分化、轉(zhuǎn)移與腫瘤分期無(wú)關(guān)（p＞0.05）；qRT-PCR和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與SH-SY5Y細(xì)胞相比，SK-N-DZ和IMR-32細(xì)胞中miR-221表達(dá)，N-myc的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增高（p＜0.05），而SK-N-SH細(xì)胞無(wú)顯著變化（p＞0.05）。
　　2.成功構(gòu)建miR-221過(guò)表達(dá)慢病毒載體；與SH-SY5

7、Y細(xì)胞相比，miR-221-up細(xì)胞中miR-221表達(dá)升高約7倍（p＜0.05）；CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-221-up細(xì)胞的增殖能力較SH-SY5Y細(xì)胞明顯增強(qiáng)（p＜0.05）；流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)miR-221-up細(xì)胞較SH-SY5Y細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例明顯減少（p＜0.05），S期細(xì)胞比例顯著增多（p＜0.05）；與 SH-SY5Y細(xì)胞注射組相比，miR-221-up細(xì)胞注射組裸鼠移植瘤的體積和重量顯著增加（p＜

8、0.05）；Ki67結(jié)果表明 miR-221-up細(xì)胞注射組Ki67陽(yáng)性細(xì)胞較SH-SY5Y細(xì)胞注射組明顯增多（p＜0.05）。
　　3.與SH-SY5Y細(xì)胞相比，qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-221-up細(xì)胞中N-myc的mRNA明顯增加（p＜0.05），而NLK和LEF1無(wú)顯著變化（p＞0.05），Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示，miR-221-up細(xì)胞中NLK和p-LEF1蛋白表達(dá)均明顯減少（p＜0.05），N-

9、myc蛋白表達(dá)明顯增加（p＜0.05），而 LEF1蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（p＞0.05）；與 SH-SY5Y細(xì)胞注射組相比，qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-221-up細(xì)胞注射組中N-myc的mRNA明顯增加（p＜0.05），而NLK和LEF1無(wú)顯著變化（p＞0.05）， Western blot和免疫組化發(fā)現(xiàn)miR-221-up細(xì)胞注射組移植瘤中NLK和p-LEF1蛋白表達(dá)均明顯降低（p＜0.05），N-myc蛋白表達(dá)明顯增多（p＜0.0