HGF通過上調(diào)miR-221及miR-26b促進(jìn)MSCs的增殖及遷移.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一種間質(zhì)來源的異質(zhì)性的多功能成體干細(xì)胞，可從多種成體組織中分離獲得。其具有多項(xiàng)分化潛能，除了能分化成中胚層的脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞外還可以分化為其他胚層的細(xì)胞。很多研究表明，MSCs能夠向組織損傷區(qū)遷移，并分泌大量具有免疫抑制作用的細(xì)胞因子從而修復(fù)損傷組織。
　　MicroRNAs(miRNAs)是由發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA剪切而來的一段20-24 nt核苷酸，其

2、通常與信使RNA(mRNA)的3'非翻譯區(qū)（Untranslated Regions，UTR）結(jié)合從而在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)。miRNAs的發(fā)現(xiàn)揭示了一個(gè)全新的基因表達(dá)調(diào)控模式，通過對靶基因的表達(dá)調(diào)控，miRNAs參與了幾乎所有的生物學(xué)進(jìn)程。miRNAs在不同的組織或細(xì)胞中的表達(dá)都不盡相同，許多miRNAs的表達(dá)在發(fā)育過程中被嚴(yán)格地調(diào)控，且具有組織特異性，表明miRNAs在發(fā)育過程中也具有重要的功能。
　　肝細(xì)胞生長因子（H

3、epatocyte growth factor，HGF）是一種間質(zhì)來源的多效性細(xì)胞因子，其能夠促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖、遷移及存活。有研究指出HGF能夠誘導(dǎo)MSCs的定向遷移，本實(shí)驗(yàn)室前期的結(jié)果表明MSCs的成神經(jīng)分化狀態(tài)影響其對HGF的趨化性遷移能力，即不同分化狀態(tài)的MSCs具有不同的向HGF的趨化性遷移能力。那么，miRNAs在這一過程中發(fā)揮著怎樣的作用呢？
　　首先我們采用25 ng/ml的HGF刺激MSCs24 h，使用miRN

4、A芯片篩選在此過程中響應(yīng)HGF刺激的miRNAs。結(jié)果顯示HGF能夠?qū)⒁幌盗衜iRNAs的表達(dá)上調(diào)3-6倍;這些miRNAs包括miR-221、miR-26b、miR-214及miR-19a等。我們采用Targetscan及miRDB等軟件尋找這些miRNAs潛在的靶基因，兩個(gè)軟件均指出大鼠p27 mRNA的3'UTR含有4個(gè)rno-miR-221的靶結(jié)合位點(diǎn)，故p27很有可能就是miR-221的靶基因。此外有文獻(xiàn)報(bào)道在人類細(xì)胞中miR

5、-221及miR-26b(實(shí)際上還包括miR-214和miR-19a)均能靶向腫瘤抑制基因PTEN。接著我們采用定量PCR的方法確證了HGF刺激能夠上調(diào)MSCs中miR-221及miR-26b的表達(dá)。因此，我們聚焦于miR-221及miR-26b，進(jìn)一步深入研究其功能及作用機(jī)制。
　　我們使用普通PCR分別克隆了大鼠miR-221及miR-26b的基因，并將它們插入到AdEasy腺病表達(dá)載體系統(tǒng)中，在293A細(xì)胞中包裝出高滴度的重

6、組腺病毒，將它們分別命名為AD-221及AD-26b。為了檢驗(yàn)p27是否為miR-221功能性的靶基因，我們克隆了p27的3'UTR全長序列，并使用PCR定點(diǎn)突變的方法將其四個(gè)miR-221的靶位點(diǎn)突變失活，最后我們將野生型及突變型的p273'UTR序列插入到雙熒光素酶報(bào)告基因的3'UTR區(qū)。使用上述載體進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果表明miR-221確實(shí)能夠通過與p27的3'UTR直接作用靶向調(diào)節(jié)該基因。由于目前還沒有大鼠PTEN基

7、因3'UTR序列的報(bào)道，我們也就無法通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測miR-221及miR-26b能否與PTEN的3'UTR區(qū)域直接作用。我們利用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在MSCs中特異性的高表達(dá)miR-221或miR-26能夠下調(diào)p27及PTEN蛋白的表達(dá)。p27是眾所周知的細(xì)胞周期抑制蛋白，其能夠通過阻斷G1/S期轉(zhuǎn)換來抑制細(xì)胞增殖，我們采用BrdU摻入染色實(shí)驗(yàn)檢測高表達(dá)miR-221或miR-26對MSCs增殖的影響，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，高

8、表達(dá)miR-221或miR-26能夠顯著增強(qiáng)MSCs的增殖能力。
　　PTEN具有脂質(zhì)磷酸酶及蛋白磷酸酶雙重活性，其在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡及遷移等過程中均發(fā)揮著重要作用。為了驗(yàn)證miR-221及miR-26b對MSCs遷移的作用，我們在細(xì)胞中分別高表達(dá)miR-221及miR-26b，隨后采用細(xì)胞劃痕愈合、Boyden chamber、活細(xì)胞跟蹤拍攝分析及細(xì)胞免疫熒光染色這四種不同的實(shí)驗(yàn)手段，在不同水平上檢測它們對MSCs遷移的

9、影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-221及miR-26b均能增強(qiáng)MSCs的遷移能力。在Boyden chamber實(shí)驗(yàn)中采用miRNA抑制劑下調(diào)MSCs中miRNA的表達(dá)，則顯著抑制了細(xì)胞的遷移。PTEN能夠通過其脂質(zhì)磷酸酶活性拮抗PI3K從而調(diào)控許多細(xì)胞功能，蛋白質(zhì)免疫印跡證實(shí)miR-221及miR-26b均能上調(diào)MSCs中AKT的磷酸化水平。
　　盡管PTEN能夠通過抑制PI3K/AKT信號通路來抑制細(xì)胞的遷移，但有報(bào)道指出PTEN

10、能夠以不依賴其脂質(zhì)磷酸酶活性的方式調(diào)控細(xì)胞遷移。LY294002是一種強(qiáng)效的PI3K抑制劑，使用它處理各組細(xì)胞30 min后使用相同的方法重復(fù)上述各遷移實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)無論是否高表達(dá)這兩種miRNAs，LY2940002均能顯著下調(diào)各組細(xì)胞的遷移能力，說明PI3K/AKT信號通路參與調(diào)控了miR-221及miR-26b對MSCs的遷移促進(jìn)作用。然而，LY2940002處理后高表達(dá)miR-221及miR-26b的MSCs與對照組相比仍然表現(xiàn)

11、出較高的遷移能力，且無論是否使用LY294002處理細(xì)胞，miR-221及miR-26b高表達(dá)組的FAK的磷酸化水平相比于對照組均有顯著升高，這表明FAK可能也參與了miR-221及miR-26b對MSCs遷移的調(diào)控。最后在MSCs中上調(diào)或下調(diào)這兩種miRNAs的表達(dá)分別進(jìn)行的Boyden chamber實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-221及miR-26b均能增強(qiáng)MSCs趨向HGF的遷移能力。
　　上述所有實(shí)驗(yàn)表明HGF刺激能夠上調(diào)MSCs中