miR-26b和miR-34a靶向HAS2、INHBB對豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控研究.pdf

1、哺乳動物卵巢中卵泡閉鎖現(xiàn)象是非常普遍的，在卵泡發(fā)育過程中，絕大部分卵泡(75％-99％)發(fā)生退化現(xiàn)象，只有極少數(shù)卵泡能成熟排卵。隨著人們對細(xì)胞凋亡研究的探索，逐漸明白到顆粒細(xì)胞的凋亡是卵泡閉鎖的主要原因。近些年來，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多抑制或促進卵泡閉鎖的因素，但是，調(diào)控卵泡閉鎖的分子機制還未完全闡明，今后仍需要做進一步的研究。研究卵泡發(fā)育和閉鎖對于人類而言，將為治療不孕、提高妊娠率有一定的指導(dǎo)意義;對于提高動物繁殖力和胚胎工程發(fā)展也有著十

2、分重要的意義。
　　隨著人們對microRNA(miRNA)的研究，人們發(fā)現(xiàn)miRNA是一大類非編碼的、有重要調(diào)控作用的、功能性RNA家族。miRNA廣泛分布于各種真核生物中，參與機體細(xì)胞增殖、分化、凋亡、胚胎發(fā)育、物質(zhì)代謝、腫瘤發(fā)生與抑制和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等各項生命活動。已有研究證實，在豬卵泡閉鎖過程中，有一些miRNA的表達量是顯著上調(diào)的并且對豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡有促進作用。因此，本文將對miRNA與顆粒細(xì)胞的凋亡關(guān)系展開研究，以

3、進一步闡明調(diào)控卵泡閉鎖的分子機制。
　　本研究試驗選取豬卵巢顆粒細(xì)胞為主要研究對象，基于本課題組研究的基礎(chǔ)和國內(nèi)外文獻資料報道，選取miR-26b和miR-34a做為研究卵泡閉鎖和顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控因子。通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測靶基因，結(jié)合靶基因的功能選取HAS2和INHBB做為候選靶基因，在HeLa229細(xì)胞中，我們利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)和定點突變試驗去驗證主效靶基因，然后，轉(zhuǎn)染豬顆粒細(xì)胞，利用Real-timePCR技術(shù)、流式細(xì)

4、胞術(shù)和WesternBlotting技術(shù)檢測miR-26b和miR-34a對豬卵巢顆粒細(xì)胞的作用以及與其靶基因的調(diào)控形式，進一步以闡明對豬卵泡閉鎖和顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控機制。全文結(jié)果如下:
　　(1)RT-PCR發(fā)現(xiàn)靶基因HAS2在豬卵巢和顆粒細(xì)胞中表達;通過雙螢光素酶報告系統(tǒng)和定點突變實驗發(fā)現(xiàn)，HAS2基因是miR-26b的直接靶基因;Real-timePCR發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-26b的顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡;流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)miR-26

5、b促進顆粒細(xì)胞的凋亡，miR-26binhibitor能抑制內(nèi)源性的miR-26b對顆粒細(xì)胞的凋亡作用;利用Real-timePCR和WestemBlotting技術(shù)證實了miR-26b在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因HAS2的表達。
　　(2)在豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)過程中，Real-timePCR檢測0h、12h、24h、36h和44h五個時間點的HAS2表達量發(fā)現(xiàn)，其mRNA的表達量顯著上升，由此可以推測在卵母細(xì)胞成熟過程中，HAS2

6、對卵丘的擴張發(fā)揮著十分重要的作用。
　　(3)RT-PCR發(fā)現(xiàn)靶基因INHBB在豬卵巢和顆粒細(xì)胞中表達;通過雙螢光素酶報告系統(tǒng)和定點突變實驗發(fā)現(xiàn)，INHBB基因是miR-26b的直接靶基因;利用Real-timePCR和WesternBlotting技術(shù)證實了miR-26b在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因INHBB的表達。
　　(4)通過雙螢光素酶報告系統(tǒng)和定點突變實驗發(fā)現(xiàn)，INHBB基因是miR-34a的直接靶基因;Real-tim

7、ePCR發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-34a的顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡;流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)miR-34a促進顆粒細(xì)胞的凋亡，miR-34ainhibitor能抑制內(nèi)源性的miR-34a對顆粒細(xì)胞的凋亡作用;利用Real-timePCR和WesternBlotting技術(shù)證實了miR-34a在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因INHBB的表達。
　　本文證實了HAS2和INHBB基因是miR-26b的靶基因，INHBB基因也是miR-34a的靶基因，miR-34a對靶