miR-34a調(diào)控Ankyrin-B表達(dá)在房顫發(fā)生中作用的研究.pdf

1、研究背景及目的:房顫(心房纖顫)在臨床上極為普遍,但由于目前對房顫的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制仍未研究透徹,以致至今對房顫的治療效果不完全理想,且遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率仍較高。目前對房顫發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識主要為電重構(gòu),結(jié)構(gòu)重構(gòu)等過程。microRNAs作為表觀遺傳學(xué)的一個組成部分,參與了各種生理、病理生理過程的發(fā)生發(fā)展,得到人們越來越多的重視。近年研究發(fā)現(xiàn)miR-34a在心臟衰老和纖維化中起到重要的作用,而其中的一個預(yù)測靶蛋白錨蛋白-B(Ankyrin-B,Ank

2、-B)在獲得性、遺傳性心臟病中的作用也得到了人們關(guān)注。目前發(fā)現(xiàn)Ankyrin-B的表達(dá)變化在房顫中發(fā)揮著重要作用,但兩者之間是否存在相互作用關(guān)系,miR-34a是否對Ank-B進(jìn)行調(diào)控,從而參與了心房重構(gòu)的發(fā)生,并在房顫的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的作用。本實驗即利用房顫患者和培養(yǎng)細(xì)胞模型進(jìn)行研究,探討microRNAs參與房顫發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制,為房顫新的治療方法的提出奠定理論基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　1.選取臨床上行瓣膜置換術(shù)的

3、風(fēng)濕性瓣膜病的房顫心律(房顫組)和竇性心律(竇性組)患者的心房組織,利用real time qPCR檢測microRNA的表達(dá),免疫組化和免疫印跡(Western Blotting)檢測Ank-B的表達(dá)。
　　2.原代培養(yǎng)SD乳鼠心房肌細(xì)胞,并利用鹽酸異丙腎上腺素刺激培養(yǎng)的心肌細(xì)胞來模擬房顫早期細(xì)胞電生理改變,real time qPCR檢測miR-34a的表達(dá)變化,并根據(jù)miR-34a的表達(dá)情況選擇鹽酸異丙腎上腺素的最佳處理時間

4、。
　　3.利用miR-34a的特異性干擾試劑,Agomir、Antagomir以及分別的陰性對照試劑Ago-N、Ant-N,對miR-34a的表達(dá)進(jìn)行干預(yù),檢測Ank-B、Na+/Ca2+交換體1(NCX1)的蛋白表達(dá)變化。
　　4.加入鹽酸異丙腎上腺素后進(jìn)一步檢驗步驟3中各項指標(biāo)的變化。
　　5.利用激光共聚焦顯微鏡檢測miR-34a的特異性干擾試劑以及鹽酸異丙腎上腺素作用下,細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號的變化。
　　

5、6.利用雙熒光素酶報告基因驗證miR-34a與Ank-B的mRNA3`端非翻譯區(qū)(Untranslated Regions,UTR)靶向結(jié)合。
　　研究結(jié)果:
　　1.miR-34a在房顫組心房組織中的表達(dá)較竇性組增高,而Ank-B的表達(dá)較竇性組降低。
　　2.利用原代培養(yǎng)的SD乳鼠心房肌細(xì)胞,給予鹽酸異丙腎上腺素刺激,并根據(jù)miR-34a的表達(dá)情況選擇出最佳鹽酸異丙腎上腺素作用時間為12h。
　　3.成功對mi

6、R-34a進(jìn)行特異性干擾,與空白組相比,Agomir組Ank-B及NCX1蛋白表達(dá)降低,Antagomir組Ank-B及NCX1蛋白表達(dá)增高,各自陰性對照組Ank-B與NCX1的表達(dá)與空白組無明顯差異。
　　4.進(jìn)一步加入鹽酸異丙腎上腺素處理后,發(fā)現(xiàn)處理后較處理前,除了Antagomir組以外,其余各組Ank-B的表達(dá)較處理前進(jìn)一步降低,NCX1表達(dá)僅在Agomir組較前進(jìn)一步降低,余較處理前變化不明顯。
　　5.激光共聚焦

7、檢測發(fā)現(xiàn),與空白組相比,鹽酸異丙腎上腺素+Agomir組細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號較其他組更強,單獨鹽酸異丙腎上腺組次之,單獨Agomir組隨后,Ca2+信號強度依次減弱。
　　6.雙熒光素酶報告基因顯示,轉(zhuǎn)染野生型(WT)ANK2載體的細(xì)胞中,與空白組相比,Agomir組熒光比值降低,Antagomir組熒光比值略增高,各自陰性對照組熒光比值與空白組無明顯差異;轉(zhuǎn)染突變型(MUT)ANK2載體的細(xì)胞中,各組熒光比值均無明顯差異。