MiR-34a在高血壓誘導(dǎo)血管損傷中的表達及其作用機制研究.pdf

1、原發(fā)性高血壓(primary hypertension)是臨床常見的一種慢性疾病，也是心腦血管病最主要的危險因素，其主要并發(fā)癥如腦卒中、心肌梗死、心力衰竭及慢性腎病等，不僅致殘、致死率高，而且嚴重消耗醫(yī)療和社會資源，給家庭和社會造成沉重負擔，對人類健康危害較大，其發(fā)病機制目前仍不明確。近年來，隨著我國人口老齡化、生活水平的改善、生活節(jié)奏加快等因素，原發(fā)性高血壓發(fā)病率持續(xù)升高，且年輕患者比例顯著增多，原發(fā)性高血壓的預(yù)防和治療引起了研究者們

2、高度重視。血管損傷是高血壓疾病的基本病理改變之一，主要包括血管內(nèi)皮細胞損傷、平滑肌細胞增殖和血管重構(gòu)等病理過程。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞損傷在高血壓的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。例如:高血壓誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞功能失調(diào)，破壞其NO與內(nèi)皮素的分泌穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)血管收縮加強，從而增加了循環(huán)阻力，促進高血壓的發(fā)展;在高血壓環(huán)境中，微血管內(nèi)皮細胞的凋亡率顯著升高，導(dǎo)致血液平行通路減少，提高了外周循環(huán)阻力，導(dǎo)致血壓升高。盡管越來越多的研究顯示，高血壓誘導(dǎo)的

3、血管內(nèi)皮細胞損傷在高血壓發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但其分子機理目前尚不明確，仍有待進一步研究。
　　MicroRNA(miRNA)是一類長度為18-24核苷酸左右的非編碼小分子RNA，其進化呈高度保守，主要通過與靶基因mRNA的3□非翻譯區(qū)（區(qū)完全或不完全結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平通過抑制蛋白質(zhì)翻譯或mRNA降解調(diào)控基因的表達。目前研究表明，高血壓患者外周血中miRNA表達譜發(fā)生了明顯改變，甚至具有高血壓早期診斷和預(yù)后判斷的臨床價值。此外，

4、在高血壓引起的并發(fā)癥中，miRNA也發(fā)揮著重要的生物學功能。此外，多種miRNA分子也參與了血管內(nèi)皮細胞損傷。MiR-34a是一個多功能調(diào)控子，通過對相關(guān)靶基因的表達調(diào)控，參與細胞分裂、衰老、凋亡和增殖的調(diào)控。然而，miRNA-34a在高血壓中的表達及作用機制仍不明確。在本研究中，我們首先檢測miR-34a在高血壓病患者外周血表達情況及其與高血壓病臨床病理特征之間的關(guān)系;然后，從體外實驗方面進行深入研究，探討miR-34a在高血壓內(nèi)皮細

5、胞損傷中的作用及其機制，這可能為高血壓的臨床治療提供新的治療靶點。
　　目的：
　　研究miR-34a在高血壓患者外周血中的表達及在高血壓誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷中的分子調(diào)控機制。
　　方法：
　　1.收集50例原發(fā)性高血壓患者外周血及28例正常健康人外周血，采用實時定量PCR檢測miR-34a的表達;
　　2.將miR-34a抑制物(miR-34a inhibitor)以及其陰性對照(scramble co

6、ntrol miRNA)分別轉(zhuǎn)入人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)中，轉(zhuǎn)染48h后進行下一步檢測。
　　3.分別采用CCK-8、Transwell及流式細胞術(shù)研究miR-34a分子對HUVECs的增殖、細胞周期、凋亡和遷移能力的影響。
　　4.采用雙熒光素酶報告實驗鑒定Tgif2是否為miR-34a靶基因。
　　5.采用Western blot檢測下調(diào)miR-34a表達后，HUVECs中miR-34a潛在靶基因Tgif2的

7、表達。
　　6.采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，所有計量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，分組比較使用成組t檢驗，以P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.MiR-34a在高血壓患者外周血中的表達及臨床意義
　　實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與正常對照組相比，高血壓患者外周血中miR-34a的表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在臨床病理特征分組比較中，高血壓3期患者外周血mi

8、R-34a表達明顯高于1期和2期患者(P＜0.05);這一結(jié)果表明，高血壓患者外周血中miR-34a的表達上調(diào)，且與高血壓進展關(guān)系緊密。
　　2.MiR-34a對HUVECs增殖能力的影響
　　CCK-8實驗結(jié)果顯示，下調(diào)miR-34a表達后，血管內(nèi)皮細胞HUVECs的體外增殖能力明顯增強，表明miR-34a具有抑制HUVECs的增殖的功能，其在高血壓患者外周血中的高表達可能抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖。
　　3.MiR-3

9、4a對HUVECs遷移能力的影響
　　Transwell實驗結(jié)果顯示，下調(diào)miR-34a表達后，HUVECs細胞遷移能力明顯升高，穿過小室膜的細胞數(shù)多于NC組(74.5±4.30 vs48.5±6.3)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);這一結(jié)果表明miR-34a能夠抑制HUVECs細胞遷移能力，在高血壓引起的血管內(nèi)皮損傷中，可能導(dǎo)致鄰近血管內(nèi)皮細胞向損傷處的遷移受抑，從而影響損傷血管內(nèi)皮細胞的修復(fù)。
　　4.MiR-34a

10、對HUVECs細胞周期的影響
　　流式細胞術(shù)檢測miR-34a對HUVECs細胞周期的影響，結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-34a inhibitor組的HUVECs出現(xiàn)了G1/S期轉(zhuǎn)換加快，表明過表達miR-34a能夠調(diào)控G1/S期轉(zhuǎn)換從而抑制HUVECs的增殖，從而抑制血管內(nèi)皮細胞的修復(fù)。
　　5.MiR-34a對HUVECs凋亡的影響
　　流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor后，人臍靜脈

11、內(nèi)皮細胞的凋亡率明顯降低(P＞0.05)，表明在高血壓發(fā)生發(fā)展過程中，降低miR-34a的表達能夠抑制HUVECs細胞凋亡，可能是高血壓誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷的作用機制之一。
　　6.Tigf2為miR-34a的靶基因
　　生物信息學分析顯示，miR-34a和Tgif2的3-UTR區(qū)存在結(jié)合位點，我們采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀬泶_定Tgif2是否為miR-34a的直接靶基因。結(jié)果表明，與NC組相比，共轉(zhuǎn)染miR-34a mimi

12、cs和Tigf2-wild type熒光素酶報告質(zhì)粒后，熒光值顯著下調(diào)(P＜0.05);而Tigf2-mutant與miR-34a mimics共轉(zhuǎn)后，熒光值并無明顯差異(P＞0.05)，表明miR-34a能與靶基因Tgif2 mRNA的3□-UTR種子區(qū)結(jié)合。免疫印跡結(jié)果顯示，下調(diào)miR-34a表達水平后，HUVECs中Tigf2蛋白表達均出現(xiàn)明顯上升(P＜0.05);提示miR-34a的生物學功能可能與Tigf2表達相關(guān)。