MiR-34a在大鼠肝臟再生終止階段的作用及機(jī)制研究.pdf

1、人和動(dòng)物的肝臟具有很強(qiáng)的再生能力。大鼠的肝臟在70％切除(PHx)后，可啟動(dòng)再生反應(yīng)，在7—10天內(nèi)基本恢復(fù)原有的體積和體質(zhì)量，這個(gè)過(guò)程叫做肝再生。肝再生的過(guò)程可以分為三個(gè)時(shí)期：?jiǎn)?dòng)期、再生期和終止期。肝再生過(guò)程受到很多種復(fù)雜因素的精密調(diào)控，包括各種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和激素等。肝臟再生與肝癌都表現(xiàn)為肝細(xì)胞極強(qiáng)的增殖能力，但兩者有明顯區(qū)別：肝癌具有無(wú)限細(xì)胞分裂和增殖能力，缺乏終止機(jī)制，而肝再生具有自動(dòng)終止機(jī)制。長(zhǎng)期以來(lái)，肝再生研究主要集中

2、在肝臟再生啟動(dòng)和增殖階段相關(guān)正調(diào)信號(hào)，而對(duì)肝臟再生終止、肝臟組織重塑和肝臟大小精確調(diào)控等負(fù)調(diào)信號(hào)及其分子機(jī)制的研究和認(rèn)識(shí)很少。因此，研究肝再生的負(fù)調(diào)機(jī)制，找出各種調(diào)控分子的變化規(guī)律和相應(yīng)的分子機(jī)制，不僅有助于對(duì)肝再生的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，對(duì)肝癌病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)和治療靶點(diǎn)的探索等也具有積極意義。
　　 microRNA(miRNA，miR)是長(zhǎng)度為22—25nt的單鏈短序列非編碼RNA，它可以與靶mRNA的3'非編碼區(qū)的特定部位結(jié)合使得翻譯

3、抑制或mRNA降解，屬于轉(zhuǎn)錄后負(fù)性調(diào)控。它參與了動(dòng)植物發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生等重要生理和病理過(guò)程。研究證明miRNAs通過(guò)下調(diào)不同癌基因或抑癌基因，而發(fā)揮抑癌基因或癌基因的作用。因此，有理由認(rèn)為這些對(duì)細(xì)胞增殖具有正調(diào)或負(fù)調(diào)作用的miRNAs可能是肝再生復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要部分。但至今有關(guān)miRNAs與肝臟再生研究還很少，幾個(gè)研究只限于肝臟再生啟動(dòng)和增殖階段，還沒(méi)肝再生終止相關(guān)的miRNAs研究報(bào)道。
　　

4、為此，本課題采用miRNAs芯片篩選大鼠肝再生后期(PHx后5d)miRNAs差異表達(dá)譜，并對(duì)顯著表達(dá)差異miRNAs檢索targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)和MAS軟件分析獲得受此miRNAs調(diào)節(jié)的相應(yīng)靶基因；進(jìn)一步利用大鼠肝臟再生模型和肝細(xì)胞系，以及熒光素酶報(bào)告基因分析和基因干預(yù)技術(shù)等來(lái)探討miRNA在肝再生終止中作用及可能機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1．miRNAs芯片篩選和驗(yàn)證
　　 大鼠肝再生后期(PHx后5d)

5、miRNAs差異表達(dá)miRNAs共10條(下調(diào)2條，上調(diào)8條)，其中表達(dá)差異達(dá)2倍以上的只有miR—34a，其上調(diào)幅度達(dá)5．6倍。在腫瘤研究中證實(shí)miR—34a是腫瘤抑制因子，它通過(guò)負(fù)調(diào)細(xì)胞周期蛋白、凋亡抑制因子和細(xì)胞增殖信號(hào)分子導(dǎo)致細(xì)胞周期終止、細(xì)胞凋亡和衰老。我們通過(guò)檢索targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)和MAS軟件分析，獲得mir—34a的靶基因，這些靶基因與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡，以及與TGF—β和HGF/c—Met通路相關(guān)的靶基因miR—

6、34a。這初步表明mir—34a可能與肝臟再生終止密切相關(guān)。我們首先選擇了INHBB(Inhibin B，主要拮抗同族的Activin A和BMP，削弱TGF—β通路信號(hào)[23])和c—Met(HGF受體，HGF/c—Met通路在肝臟再生中具有重要作用)兩個(gè)靶基因，在大鼠肝再生模型和細(xì)胞水平上進(jìn)一步驗(yàn)證了INHBB和c—Met與miR—34a關(guān)系。
　　 2．miR—34a、INHBB和c—Met在大鼠肝臟再生中的表達(dá)
　

7、　 miR—34a在大鼠肝臟再生全程的表達(dá)規(guī)律：PHx后3d時(shí)miR—34a顯著上調(diào)，5d時(shí)表達(dá)最高，是對(duì)照組的6倍以上，9d時(shí)基本恢復(fù)到正常水平。
　　 PHx后5d時(shí)INHBB和c—Met的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均顯著下降，呈現(xiàn)與miR—34a反相表達(dá)。該結(jié)果提示INHBB和c—Met在肝再生過(guò)程中可能受miR—34a調(diào)節(jié)。
　　 3．miR—34a對(duì)肝細(xì)胞系(BRL—3A)生物學(xué)功能及靶基因的影響
　　

8、 用miR—34a的mimics轉(zhuǎn)染大鼠肝細(xì)胞BRL—3A后，用MTT法來(lái)檢測(cè)miR—34a對(duì)大鼠肝臟細(xì)胞增殖調(diào)控的影響，在4天時(shí)可觀察到miR—34a對(duì)BRL—3A細(xì)胞的增殖抑制作用，6天時(shí)抑制作用達(dá)到最高水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了miR—34a可以抑制大鼠正常肝細(xì)胞增殖。隨后，用miR—34a的mimics轉(zhuǎn)染大鼠肝細(xì)胞BRL—3A后48h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期的變化情況，發(fā)現(xiàn)處理后細(xì)胞滯留在G2期，miR—34a組G2期細(xì)胞比例

9、為(23．144±4．26)％，對(duì)照組(NC)為(8．484±2．93)％，同時(shí)出現(xiàn)明顯的凋亡峰。這表明miR—34a有明顯負(fù)調(diào)肝細(xì)胞功能。
　　 用miR—34a mimics轉(zhuǎn)染大鼠正常肝細(xì)胞BRL—3A，檢測(cè)miR—34a對(duì)靶基因的調(diào)控。結(jié)果證明，miR—34a可以負(fù)調(diào)MET和INHBB的水平。
　　 4．miR—34a負(fù)調(diào)INHBB表達(dá)
　　 雖然c—Met在HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中已證實(shí)為miR—

10、34a的靶基因(He et al．2007；Li et al．2009)。而miR—34a是否直接調(diào)節(jié)INHBB還沒(méi)有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，所以我們首先選擇INHBB作螢光素酶報(bào)告基因分析，將INHBB基因的3'—UTR(INHBB—UTR)和突變3'—UTR(INHBB—Mu—UTR)分別并與螢光素酶報(bào)告基因重組，并與miR—34a的mimics共轉(zhuǎn)BRL—3A細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR—34a抑制融合了INHBB—UTR的螢光素酶基因表達(dá)，而融合IN

11、HBB—Mu—UTR的螢光素酶基因表達(dá)不受影響，這表明miR—34a可直接下調(diào)INHBB。
　　 5．在體動(dòng)物下調(diào)miR—34a的初步研究
　　 利用慢病毒在體干預(yù)miR—34a基因表達(dá)，進(jìn)一步在動(dòng)物水平上探討miR—34a在肝再生終止中的作用。結(jié)果顯示下調(diào)miR—34a的動(dòng)物肝再生度有較顯著高于對(duì)照組。這表明下調(diào)miR—34a后可能影響肝再生的終止進(jìn)程。
　　 結(jié)論：
　　 miR—34a與大鼠肝再生終