miR-133b調(diào)控CTGF表達(dá)在結(jié)直腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:結(jié)直腸癌是世界上高發(fā)的消化道惡性腫瘤之一，死亡率高。我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，危害人們的生命健康。結(jié)直腸癌致病致死的主要原因是腫瘤的轉(zhuǎn)移，而腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵所在。EMT是指具有上皮表型的細(xì)胞在多種生理或病理因素的刺激下，上皮結(jié)構(gòu)消失，失去細(xì)胞極性和緊密連接，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)骨架成分重排并獲得移行能力等間質(zhì)細(xì)胞的

2、特性，轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型細(xì)胞的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，EMT現(xiàn)象在多種惡性腫瘤的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中存在，說明兩者有著密切的聯(lián)系。microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性并且高度保守的非編碼小分子RNA，大小約22個(gè)核苷酸左右，通過與靶基因mRNA3'-UTR的堿基互補(bǔ)配對(duì)后，抑制mRNA翻譯過程或促進(jìn)mRNA的降解，能抑制靶基因在轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)，從而調(diào)控基因發(fā)揮生物功能。目前對(duì)miRNA的生物學(xué)功能眾說紛紜，研究主要集中在miRNA調(diào)節(jié)生物體生長(zhǎng)

3、、發(fā)育、細(xì)胞分化、凋亡及腫瘤形成等眾多方面，尤其在某些惡性腫瘤當(dāng)中，miRNA可以調(diào)控不同的靶基因的特性，使得其能夠來(lái)充當(dāng)類似于原癌或抑癌基因的角色。最近的研究結(jié)果證實(shí)，miRNA-133 b(miR-133b)的表達(dá)異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，對(duì)腫瘤形成有促進(jìn)作用，miR-133b在結(jié)腸癌中的差異表達(dá)已經(jīng)被報(bào)道，但是其在結(jié)直腸癌中致癌、腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制及作用尚未完全明確。
　　方法:本研究小組前期研究已經(jīng)證實(shí)，miR-133b是一

4、種新發(fā)現(xiàn)的在結(jié)直腸癌中具有抑瘤作用的miRNA，但仍有許多關(guān)鍵的問題沒有得到解答，需進(jìn)一步深入研究。本課題在前期工作的基礎(chǔ)上，擬開展研究工作如下:1）通過靶點(diǎn)驗(yàn)證及細(xì)胞功能驗(yàn)證，對(duì)miR-133b在結(jié)直腸癌中的作用靶點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)分析和深入的研究，有望闡明miR-133b在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)理;2）通過在結(jié)直腸癌標(biāo)本中檢測(cè)miR-133b及其靶基因的表達(dá)特征，分析miR-133b與結(jié)直腸癌各病理指標(biāo)及臨床指標(biāo)之間的關(guān)系;3）通過結(jié)直腸癌EM

5、T過程中的分子調(diào)控機(jī)制分析結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的可能原因。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.miR-133b與CTGF在結(jié)直腸癌中的靶點(diǎn)驗(yàn)證
　　生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及基因芯片結(jié)果提示miR-133b的潛在靶基因參與TGF-β和Colorectal cancer pathway等通路。綜合分析數(shù)據(jù)并進(jìn)一步選擇CTGF基因進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測(cè)SW620、HT29細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-133b過表達(dá)模擬物(m

6、imics)和抑制表達(dá)載體(inhibitor)后靶基因的表達(dá)。結(jié)果初步提示miR-133b靶基因?yàn)镃TGF。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn):構(gòu)建了含CTGF與miR-133b結(jié)合位點(diǎn)序列及其缺失突變型的pYr-Mir載體，運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果提示:CTGF是miR-133b調(diào)控的靶基因。Western-blot證實(shí)轉(zhuǎn)染miR-133b前后CTGF蛋白表達(dá)下調(diào)，表明:CTGF受miR-133b的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。
　　2.miR-1

7、33b與CTGF在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床病理特征相關(guān)性分析
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)71對(duì)癌組織及癌旁組織樣本中miR-133b的表達(dá)。結(jié)果顯示:在66例癌組織樣本中，miR-133b表達(dá)與配對(duì)癌旁組織相比明顯下調(diào)，僅5例癌組織樣本中miR-133b表達(dá)升高，存在顯著性差異;CTGF在結(jié)直腸癌、癌旁組織中的免疫組化結(jié)果顯示:結(jié)直腸癌組織中CTGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性率相比配對(duì)癌旁組織明顯升高，存在顯著性差異。Real-time PCR及

8、免疫組化結(jié)果顯示，miR-133b及CTGF的陽(yáng)性表達(dá)與TNM分期以及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與年齡、性別、分化程度、腫瘤大小和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。
　　3.miR-133b調(diào)控結(jié)直腸癌EMT過程的分子機(jī)制分析
　　細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-133b質(zhì)粒后，細(xì)胞形態(tài)由紡錘形向類圓形改變，E-cadherin免疫熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，vimentin免疫熒光強(qiáng)度減弱;RT-PCR和Western blot證實(shí)代表上皮細(xì)胞表型的E-cadherin表達(dá)水平

9、升高，代表間質(zhì)細(xì)胞表型的vimentin表達(dá)水平下降;Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染miR-133b質(zhì)粒后CRC細(xì)胞的侵襲和遷移能力均下降。共轉(zhuǎn)染miR-133b與CTGF過表達(dá)質(zhì)粒后，E-cadherin免疫熒光強(qiáng)度減弱，vimentin免疫熒光強(qiáng)度增強(qiáng);RT-PCR和Western blot證實(shí)代表上皮細(xì)胞表型的E-cadherin表達(dá)水平下降，代表間質(zhì)細(xì)胞表型的vimentin表達(dá)水平上升;Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)共轉(zhuǎn)染后CRC

10、細(xì)胞的侵襲和遷移能力均上升。跟正常結(jié)直腸組織相比，結(jié)直腸癌組織中E-cadherin表達(dá)水平明顯下降，CTGF及vimentin表達(dá)水平明顯升高;組織中CTGF蛋白表達(dá)水平與E-cadherin呈負(fù)相關(guān)性，與vimentin呈正相關(guān)性;CTGF表達(dá)水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、臨床進(jìn)展等臨床病理特征密切相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.miR-133b在結(jié)直腸癌中是一種抑癌基因，可通過抑制靶基因CTGF達(dá)到抑制腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的效應(yīng)。<