miR-200a和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在結(jié)直腸癌中的研究.pdf

1、研究背景:
　　 結(jié)直腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，由于早期發(fā)現(xiàn)和治療方法的進(jìn)步，結(jié)直腸癌的死亡率在過去三十年有一定程度下降，但隨著人們生活水平的提高以及生活方式的改變，近年來我國的結(jié)直腸癌發(fā)病率卻有所上升。侵襲轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌治療失敗導(dǎo)致患者死亡的最主要原因。因此，探討與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的因素勢在必行。
　　 惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個多因素、多步驟的復(fù)雜生物學(xué)行為過程。對惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移機(jī)制和尋

2、求新的特效治療方法與手段一直是研究熱點。近年來微小RNA(microRNA，miRNA)逐漸被研究者重視，成為腫瘤研究的熱點。miRNA是真核生物細(xì)胞中一類長度約為18-24核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA。它由DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，但并不翻譯蛋白質(zhì)，而是在蛋白質(zhì)合成中起調(diào)節(jié)其他基因的功能，是調(diào)控其他蛋白質(zhì)編碼基因的基因。miRNA通過與靶基因mRNA的3'-非編碼區(qū)(3'-untranslated region，3'-UTR)以完全或不完全

3、互補(bǔ)配對的方式結(jié)合，降解或者抑制靶基因mRNA。miRNA與基因之間的作用是錯綜復(fù)雜的，一個miRNA可調(diào)控多個基因的mRNAs，一個基因的mRNAs也可由多個miRNAs調(diào)控，此外，基因也可參與對miRNAs的調(diào)控。
　　 miR-200家族是近年來研究的熱點，miR-200a作為miR-200家族（包括miR-200a，miR-200b，miR-200c，miR-114，miR-429）的一員在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，主要通過調(diào)

4、控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程，對腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移起到關(guān)鍵作用。腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生包括諸多因素，主要有轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)以及各種信號通路激活。大量研究表明AKT和ERK信號通路的激活在結(jié)直腸癌EMT的發(fā)生中起到重要作用，另外有報道稱在人肝癌細(xì)胞系和人胰腺癌細(xì)胞系中miR-200a能通過其靶基因調(diào)控AKT信號通路活性，但在人結(jié)直腸癌中miR-200a、EMT和AKT/ERK

5、信號通路三者間的關(guān)系尚未見相關(guān)報道。在大多數(shù)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，miR-200a充當(dāng)抑癌基因的功能。miR-200a在結(jié)直腸癌的表達(dá)情況各報道不盡一致，有研究顯示miR-200a在結(jié)直腸癌中表達(dá)下調(diào)，但也有研究稱miR-200a在結(jié)直腸癌的表達(dá)是上調(diào)的，對于miR-200a在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)作用及機(jī)制少見報道。本研究組前期研究顯示miR-200a在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)是下調(diào)的，并且miR-200a與結(jié)直腸癌組織分化和侵襲轉(zhuǎn)移潛

6、能相關(guān)，在此基礎(chǔ)上，本研究通過在三種人結(jié)直腸癌細(xì)胞系中上調(diào)或下調(diào)miR-200a的表達(dá)觀察其對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物及AKT/ERK信號通路相關(guān)蛋白變化，探討結(jié)直腸癌中miR-200a與EMT的關(guān)系及相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 EMT最初在胚胎發(fā)育過程中如原腸胚形成、腎器官發(fā)育及神經(jīng)嵴形成中被描述。隨著EMT在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用被廣泛研究，普遍認(rèn)為發(fā)生EMT的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)，能夠發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的癌

7、細(xì)胞EMT特征往往較明顯。然而，從非侵襲性腫瘤到侵襲性腫瘤是否真正存在EMT仍然存在爭議。一個最主要的質(zhì)疑觀點就是原發(fā)性腫瘤與其轉(zhuǎn)移性腫瘤具有組織病理學(xué)相似性。有研究稱EMT細(xì)胞和非EMT細(xì)胞共同協(xié)作完成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程，EMT細(xì)胞負(fù)責(zé)降解細(xì)胞周圍基質(zhì)，為非EMT細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移開路，最終能在遠(yuǎn)處部位定植的是非EMT細(xì)胞而不是EMT細(xì)胞。甚至有學(xué)者質(zhì)疑腫瘤發(fā)生EMT的真實性。為了解釋這些疑點，在轉(zhuǎn)移部位的間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(mesenchyma

8、l-epithelial transition，MET)作為一個假設(shè)在轉(zhuǎn)移性腫瘤形成過程中被提了出來。根據(jù)這個假設(shè)，發(fā)生EMT的細(xì)胞改變其黏附性及激活蛋白質(zhì)分解而具備移動性，允許它們離開原發(fā)腫瘤，在遠(yuǎn)處部位建立繼發(fā)腫瘤。在遠(yuǎn)處部位定植過程中，一個逆轉(zhuǎn)的過程—MET發(fā)生了，轉(zhuǎn)移性腫瘤重新獲得了上皮表型。MET的假設(shè)可以很好地解釋原發(fā)性腫瘤與其轉(zhuǎn)移性腫瘤為何具有組織病理學(xué)相似性。但是，對腫瘤轉(zhuǎn)移過程MET的發(fā)生至今仍然缺乏直接實驗證據(jù)。本研

9、究通過探討結(jié)直腸癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織及結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480、SW620的EMT特征差異，期望進(jìn)一步了解EMT在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用。并且通過對比多種上皮性腫瘤的原發(fā)癌、轉(zhuǎn)移癌與其癌栓的組織形態(tài)學(xué)特點及E-cadherin和Vimentin表達(dá)情況，從組織學(xué)水平探討腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中是否遵循EMT-MET機(jī)制。
　　 為了深入了解結(jié)直腸癌發(fā)病的分子機(jī)制和尋找新的治療靶點，本課題著重進(jìn)行了如下研究，來探討miR-200a和E

10、MT在結(jié)直腸癌中的作用。
　　 目的:
　　 1.探討通過上調(diào)和下調(diào)miR-200a的表達(dá)對人結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　 2.通過觀察在人結(jié)直腸癌細(xì)胞中下調(diào)和上調(diào)miR-200a表達(dá)對EMT相關(guān)標(biāo)志物及AKT/ERK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-200a與EMT的關(guān)系及相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 3.通過對比多種上皮性腫瘤的原發(fā)癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌與其癌栓的組織形態(tài)學(xué)特點及E-ca

11、dherin和Vimentin表達(dá)情況，從組織學(xué)水平探討EMT在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的作用。
　　 4.探討結(jié)直腸癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織及結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480、SW620的EMT特征差異，進(jìn)一步了解EMT在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用。
　　 方法:
　　 1.將inhibitor/miR-200a和mimics/miR-200a分別瞬時轉(zhuǎn)染入結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116、SW480和LoVo、SW480來下調(diào)和上調(diào)mi

12、R-200a的表達(dá)，通過實時熒光定量PCR檢測下調(diào)和上調(diào)效果，然后通過CCK-8、TUNEL法、Transwell遷移實驗及同質(zhì)性細(xì)胞黏附實驗檢測細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和黏附能力;實時熒光定量PCR和細(xì)胞蠟塊免疫化學(xué)方法檢測E-cadherin和Vimentin在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化;Western Blot檢測細(xì)胞中相關(guān)基因( PTEN、p-AKT、p-ERK1/2、AKT、ERK2、CD147、MMP-9)在蛋白水平的表達(dá)變

13、化。
　　 2.生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-200a與PTEN結(jié)合情況。
　　 3.59例經(jīng)病理診斷證實的原發(fā)性腺癌或原發(fā)性鱗狀細(xì)胞癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌患者的68個石蠟組織標(biāo)本，其中高分化癌組織13例，中分化癌11例，低分化癌30例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌14例，每例均有血管內(nèi)或淋巴管內(nèi)癌栓。挑選同一切面上同時具有癌組織（包含原發(fā)癌或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌）及癌栓的蠟塊進(jìn)行HE染色觀察形態(tài)及免疫組織化學(xué)檢測E-cadherin和Vimentin

14、表達(dá)。
　　 4.實時熒光定量PCR檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480和SW620 E-cadherin和Vimentin的mRNA表達(dá);免疫組化檢測30例配對結(jié)直腸癌及其轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的石蠟組織標(biāo)本中E-cadherin和Vimentin的表達(dá)，HE染色觀察30例配對結(jié)直腸癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織形態(tài)以及SW480和SW620的細(xì)胞形態(tài)。
　　 結(jié)果:
　　 1.下調(diào)miR-200a的表達(dá)對HCT116和SW480的影響<

15、br>　　 下調(diào)HCT116和SW480中miR-200a的表達(dá)后，實時熒光定量PCR檢測48h抑制效率分別約為50.9％和54.4％。CCK-8法顯示，HCT116和SW480各自三組間細(xì)胞增殖能力存在顯著性差異（分別F=4.009，P=0.031;F=6.122，P=0.004），兩種細(xì)胞的miR-200a/inhibitor組的增殖能力均比blank組和negative control組顯著增加（P=0.038，P=0.034和

16、P=0.004，P=0.003）;Transwell遷移實驗顯示，HCT116和SW480各自三組間細(xì)胞的穿膜數(shù)量存在顯著性差異（分別F=102.452，P=0.000;F=41.632，P=0.000），兩種細(xì)胞的miR-200a/inhibitor組的穿膜數(shù)量均比blank組和negative control組顯著增多（全部P=0.000）;TUNEL法檢測顯示，HCT116和SW480的各自三組間凋亡指數(shù)存在顯著性差異（分別F=1

17、9.932，P=0.000;F=34.720，P=0.000），兩種細(xì)胞的miR-200a/inhibitor組的凋亡指數(shù)均比blank組和negative control組顯著減少（分別P=0.003，P=0.003和P=0.001，P=0.000）;同質(zhì)性細(xì)胞黏附實驗顯示，HCT116和SW480的同質(zhì)性黏附能力較negative control組顯著減弱（分別t=8.060，P=0.000; t=3.668，P=0.004）;實時

18、熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，miR-200a表達(dá)下調(diào)后，在mRNA水平E-cadherin表達(dá)顯著下降（分別t=-27.163，P=0.001;t=-5.079，P=0.037）、Vimentin的表達(dá)顯著升高（分別t=75.054，P=0.000; t=14.068，P=0.005）;細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示，下調(diào)miR-200a的表達(dá)后，HCT116和SW480 E-cadherin的表達(dá)減弱、Vimentin的表達(dá)增強(qiáng)。Western

19、 Blot顯示下調(diào)miR-200a后，HCT116和SW480 PTEN的表達(dá)減弱，p-AKT、p-ERK1/2,CD147和MMP-9的表達(dá)增強(qiáng)，而AKT，ERK2表達(dá)無變化。
　　 2.上調(diào)miR-200a的表達(dá)對LoVo和SW480的影響
　　 上調(diào)LoVo和SW480中miR-200a的表達(dá)后，實時熒光定量PCR檢測48hmiR-200a/mimics組表達(dá)倍數(shù)為negative control組2053倍和10

20、2倍。CCK-8法顯示LoVo和SW480各自三組間細(xì)胞增殖能力存在顯著性差異（分別F=101.928，P=0.000; F=27.583，P=0.000），兩種細(xì)胞的miR-200a/mimics組的增殖能力均比blank組和negative control組顯著減弱（全部P=0.000）;Transwell遷移實驗顯示，LoVo和SW480各自三組間細(xì)胞的穿膜數(shù)量存在顯著性差異（分別F=119.464，P=0.000; F=58.6

21、70，P=0.000），兩種細(xì)胞的miR-200a/mimics組的穿膜數(shù)量均比blank組和negative control組顯著減少（全部P=0.000）;TUNEL法檢測顯示，LoVo和SW480的各自三組間凋亡指數(shù)存在顯著性差異（分別F=25.620，P=0.000;F=25.159, P=0.000），兩種細(xì)胞的miR-200a/mimics組的凋亡指數(shù)均比blank組和negative control組顯著增多（全部P=0.

22、000）;同質(zhì)性細(xì)胞黏附實驗顯示上調(diào)miR-200a的表達(dá)后，LoVo和SW480的同質(zhì)性黏附能力較negative control組顯著增強(qiáng)（分別t=-4.250，P=0.005; t=-4.190，P=0.006）;實時熒光定量PCR檢測顯示，miR-200a表達(dá)上調(diào)后，LoVo和SW480在mRNA水平的E-cadherin表達(dá)顯著增加（分別t=15.006，P=0.004; t=23.844，P=0.002）、Vimentin的

23、表達(dá)顯著減少（分別t=-6.010，P=0.027; t=-9.081，P=0.012）;細(xì)胞免疫化學(xué)顯示上調(diào)miR-200a表達(dá)后，LoVo和SW480 E-cadherin的表達(dá)增強(qiáng)、Vimentin的表達(dá)減弱。Western Blot顯示上調(diào)miR-200a后，LoVo和SW480 PTEN的表達(dá)增強(qiáng)，p-AKT、p-ERK1/2、CD147和MMP-9的表達(dá)減弱，而AKT，ERK2表達(dá)無變化。
　　 3.生物信息學(xué)軟件預(yù)

24、測顯示PTEN是miR-200a的潛在靶基因。
　　 4.癌組織與癌栓具有相似形態(tài)特征;54例原發(fā)性癌組織E-cadherin和Vimentin陽性分別為50例和23例，其癌栓陽性分別為51例和22例，經(jīng)統(tǒng)計兩者的E-cadherin和Vimentin表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（分別Z=-0.248，P=0.804;Z=-0.199，P=0.842）;14例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性癌組織E-cadherin和Vimentin陽性分別為12例和6例

25、，其癌栓E-cadherin和Vimentin陽性分別為12例和7例，兩者的E-cadherin和Vimentin表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（分別Z=-1.727，P=0.084;Z=-0.154，P=0.878）;癌組織（包含原發(fā)癌或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌）及其癌栓的E-cadherin和Vimentin的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（分別Z=-0.824，P=0.410;Z=-0.222，P=0.824）;癌栓部分癌細(xì)胞高表達(dá)E-cadherin而Vim

26、entin缺失，部分癌細(xì)胞高表達(dá)Vimentin而E-cadherin缺失。
　　 5.SW480與SW620中E-cadherin和Vimentin的mRNA表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（分別t=10.837，P=0.008; t=4.796，P=0.041），均以后者為高;E-cadherin和Vimentin在結(jié)直腸癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(分別Z=-0.235，P=0.814; Z=-0.479，P=0.

27、632)。部分淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中E-cadherin的表達(dá)高于結(jié)直腸癌(4/30)，且Vimentin表達(dá)比結(jié)直腸癌弱，甚至表達(dá)缺失(6/30);結(jié)直腸癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織具有相似的形態(tài)學(xué)特征;SW480和SW620兩者形態(tài)類似。
　　 結(jié)論:
　　 1.miR-200a在人結(jié)直腸癌中起抑癌基因作用，miR-200a表達(dá)的下調(diào)能減弱結(jié)直腸癌細(xì)胞間黏附能力，增加細(xì)胞遷移、增殖能力而阻遏凋亡，從而影響結(jié)直腸癌的進(jìn)展。
　

28、　 2.miR-200a能調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT，并通過調(diào)節(jié)、控制AKT/ERK通路活性及其上下游眾多重要基因而最終影響結(jié)直腸癌EMT，從而在結(jié)直腸癌中起到多功能的生物學(xué)調(diào)控作用包括細(xì)胞增殖、凋亡、黏附、遷移和侵襲轉(zhuǎn)移。
　　 3.原發(fā)癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌、癌栓三者EMT特征無顯著差異;癌栓細(xì)胞既有EMT細(xì)胞也有非EMT細(xì)胞，推測發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞改變它們的黏附性及激活蛋白質(zhì)分解而具備移動性，允許它們離開原發(fā)腫瘤進(jìn)入脈管;進(jìn)入

29、脈管的部分EMT細(xì)胞發(fā)生了MET從而癌栓細(xì)胞既有EMT細(xì)胞也有非EMT細(xì)胞，而未發(fā)生MET的EMT細(xì)胞為遠(yuǎn)處部位建立轉(zhuǎn)移癌灶提供了可能;在轉(zhuǎn)移癌灶中部分癌細(xì)胞發(fā)生MET，重新獲得上皮表型，部分癌細(xì)胞仍保留EMT特征，所以原發(fā)癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的EMT特征無顯著差異，而部分癌細(xì)胞保留EMT特征可能是更遠(yuǎn)部位發(fā)生轉(zhuǎn)移的原因。
　　 4.結(jié)直腸癌與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織和細(xì)胞的EMT特征無顯著差異，推測機(jī)制與結(jié)論3相同，但這需要進(jìn)一步實驗