丙戊酸鈉通過上調(diào)miR-34a的表達(dá)抑制SMAD4在前列腺癌中的表達(dá).pdf

1、前列腺癌作為一種男性惡性腫瘤，在歐美等國(guó)非常常見。近年來隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)生活水平的提高，飲食及文化相關(guān)的發(fā)展，社會(huì)的老齡化及查體的普及，前列腺癌在我國(guó)的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。前列腺癌患者發(fā)病時(shí)一般較晚，許多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，其最常見的轉(zhuǎn)移為骨轉(zhuǎn)移。而研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者的高病死率與其高轉(zhuǎn)移率密切相關(guān)，因此，人們?cè)絹碓疥P(guān)注針對(duì)前列腺癌患者轉(zhuǎn)移相關(guān)的治療。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指原位腫瘤細(xì)胞，在受到物理或化學(xué)因素的作用下，從

2、而失去了細(xì)胞極性、細(xì)胞間黏附等上皮細(xì)胞的特性，并獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性時(shí)，轉(zhuǎn)化成為能夠向細(xì)胞外基質(zhì)侵襲并向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的細(xì)胞。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)已被證實(shí)在前列腺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，其調(diào)控機(jī)制由多個(gè)信號(hào)通路綜合參與引導(dǎo)，包括TGF-β、Notch、Wnt以及ERK/MAPK等通路。其中TGF-β/SMAD4通路對(duì)腫瘤特別是晚期時(shí)的EMT發(fā)展密切相關(guān)。SMADs是哺乳動(dòng)物TGF-β超家族信號(hào)傳導(dǎo)的下游信號(hào)蛋白，它們可將TGF-β信號(hào)由細(xì)

3、胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核，并與DNA及一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用。SMAD4即在TGF-β/SMAD4信號(hào)通路中起到關(guān)鍵的“渡船”的作用。因此當(dāng)抑制SMAD4的表達(dá)時(shí)，可以抑制TGF-β通路信號(hào)傳遞，阻止上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在腫瘤細(xì)胞中發(fā)生。
　　近年來發(fā)現(xiàn)的miRNA是一組非編碼小RNA，其作用涉及眾多生理、病理過程，主要表現(xiàn)為抑制mRNA的翻譯或誘導(dǎo)其降解，從而改變靶蛋白的表達(dá)水平。關(guān)于miRNA的研究成為當(dāng)前的熱點(diǎn)，大量研究證明miR

4、NA在不同的腫瘤中均有不同的表達(dá)，且發(fā)揮著重要的作用:例如部分miRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞中的EMT起促進(jìn)作用，而部分miRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞中的EMT起抑制作用。因此將來治療腫瘤通過研究針對(duì)miRNA靶向治療藥物會(huì)有很大的發(fā)展前景。
　　目前大量的研究表明，丙戊酸鈉(VPA)可抑制前列腺癌(PCa)細(xì)胞轉(zhuǎn)移并且相應(yīng)的下調(diào)SMAD4蛋白表達(dá)水平。然而VPA對(duì)前列腺癌細(xì)胞中SMAD4表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控的過程中，是否存在miRNA的參與，這其中涉及的具

5、體機(jī)制目前尚不清楚。如果通過實(shí)驗(yàn)找到影響SMAD4表達(dá)的核心miRNA，就可以針對(duì)該miRNA的作用機(jī)制研究相關(guān)的藥物治療。這種針對(duì)性更強(qiáng)的治療可能會(huì)效果更好且可以減少并發(fā)癥，對(duì)前列腺癌的治療將有著重要的意義。
　　目的：
　　前期研究已證實(shí)丙戊酸鈉(VPA)可抑制前列腺癌(PCa)細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并且能通過下調(diào)SMAD4表達(dá)水平阻斷EMT的發(fā)生。通過本實(shí)驗(yàn)，我們研究丙戊酸鈉(VPA)通過何種途徑下調(diào)SMAD4蛋白表達(dá)水平，尋找是

6、否存在相關(guān)的miRNA與其調(diào)控密切相關(guān)，找到這種miRNA并探索能否通過該miRNA的調(diào)控，改變SMAD4的表達(dá)水平，從而確定其是否在SMAD4的表達(dá)過程中起到關(guān)鍵作用，為前列腺癌的治療尋找新的治療靶點(diǎn)。
　　方法：
　　我們通過使用www.targetscan.com查找可以與SMAD4互補(bǔ)結(jié)合miRNAs，然后通過在PubMed上搜索及進(jìn)行文獻(xiàn)復(fù)習(xí)確定與VPA相關(guān)的miRNA，將同時(shí)與SMAD4及VPA相關(guān)的miRNA作

7、為我們的研究對(duì)象。
　　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)首先培養(yǎng)兩種前列腺癌細(xì)胞株(PC3、LNCaP)，在應(yīng)用VPA處理后，檢測(cè)SMAD4的蛋白和mRNA水平有無變化，變化有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。再次用VPA處理前列腺癌細(xì)胞株，觀察是否對(duì)作為研究對(duì)象的miRNA表達(dá)水平產(chǎn)生影響。選擇應(yīng)用VPA處理后的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的miRNA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，分別植入轉(zhuǎn)染相應(yīng)miRNA前體及miRNA抑制劑后，檢測(cè)其對(duì)前列腺癌細(xì)胞中SMAD4表達(dá)的影響。選出

8、對(duì)SMAD4表達(dá)產(chǎn)生有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義影響的miRNA作為最終目標(biāo)。最后將通過相應(yīng)的miRNA抑制劑將選出的目標(biāo)miRNA的表達(dá)進(jìn)行抑制，觀察其能否消除VPA對(duì)SMAD4的影響，以評(píng)價(jià)其是否在VPA抑制SMAD4的表達(dá)過程中起到關(guān)鍵的作用。
　　結(jié)果：
　　通過使用www.targetscan.com查找可以與SMAD4互補(bǔ)結(jié)合miRNAs，然后通過在PubMed上搜索及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)確定與VPA相關(guān)的miRNA，我們將同時(shí)與SMAD4

9、及VPA相關(guān)的5種miRNA作為我們的研究對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別是miR-20a，miR-34a，miR-124a,miR-144和miR-449a。
　　我們通過實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證在經(jīng)過VPA處理后，前列腺癌細(xì)胞株中SMAD4的mRNA和蛋白的水平均明顯下調(diào)，且具有明顯的濃度依賴性。之后我們用VPA處理前列腺癌細(xì)胞株，從初步篩選的5種miRNA中，發(fā)現(xiàn)miR-20a、miR-34a與miR-449a的表達(dá)水平在VPA處理后增加且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、意義，而對(duì)miR-124a，miR-144的表達(dá)則無明顯變化。因此我們將miR-20a、miR-34a與miR-449a作為下一步的研究目標(biāo)。
　　我們通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，在兩種前列腺癌細(xì)胞株(LNCaP、PC3 cells)中分別植入轉(zhuǎn)染miR-20a、miR-34a與miR-449a前體及miR-20a、miR-34a與miR-449a抑制劑后，發(fā)現(xiàn)通過轉(zhuǎn)染pre-miR-34a降低SMAD4的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染pre-miR-20a

11、或者pre-miR-449a則均增加了SMAD4的表達(dá)，且SMAD4表達(dá)的變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而通過轉(zhuǎn)染miR-34a抑制劑，增加了SMAD4的表達(dá);而轉(zhuǎn)染miR-20a或者miR-449a抑制劑，則均減少了SMAD4的表達(dá)。在前列腺癌細(xì)胞株LNCaP中，通過轉(zhuǎn)染miR-34a抑制劑后SMAD4表達(dá)的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而轉(zhuǎn)染miR-20a抑制劑或者miR-449a抑制劑后SMAD4表達(dá)的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3 cell

12、s中，通過轉(zhuǎn)染pre-miR-34a抑制劑、pre-miR-20a抑制劑、pre-miR-449a抑制劑后SMAD4表達(dá)的變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-34a的前體及抑制物均能對(duì)SMAD4的蛋白及mRNA表達(dá)水平有顯著的影響，miR-34a在VPA影響SMAD4表達(dá)過程中應(yīng)該起到重要作用，因此我們選擇miR-34a作為研究對(duì)象進(jìn)入下一組實(shí)驗(yàn)。
　　在兩種前列腺癌細(xì)胞株(LNCaP、PC3 cells)中，通過轉(zhuǎn)染

13、pre-miR-34a抑制劑來增加SMAD4蛋白水平的表達(dá)，然后再加用VPA處理，SMAD4蛋白水平并沒有明顯改變，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)在兩種前列腺癌細(xì)胞株(LNCaP、PC3 cells)中，應(yīng)用轉(zhuǎn)染pre-miR-34a抑制劑后再應(yīng)用VPA處理，SMAD4的mRNA水平的變化也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明降低miR-34a的表達(dá)可消除VPA對(duì)SMAD4的抑制效果。即上調(diào)miR-34a水平可模擬SMAD4被VPA抑制時(shí)的效果，而下調(diào)miR-3

14、4a的水平消除VPA在前列腺癌細(xì)胞的影響。
　　結(jié)論：
　　丙戊酸鈉(VPA)可上調(diào)miR-20a，miR34a，miR449a在前列腺癌細(xì)胞株LNCaP和PC3中的表達(dá)水平。
　　抗癌miRNA中的miR-449a在經(jīng)過VPA治療后其表達(dá)明顯上調(diào)，這提示miR-449a可能參與VPA的其它復(fù)雜的作用機(jī)制。
　　pre-miR-20a或pre-miR-449a轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)了SMAD4蛋白水平上調(diào)，這可能主要是由于間接